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>1. 2光子レーザー顕微鏡を用いたニューロンの亜集団のアブレーション
>注:アブレーション後にCaイメージングを実行する予定の場合は、UAShspzGCaMP6sラインを使用してください。ユーザーがアブレーション後に行動記録を行うことを計画している場合は、EGFP陽性細胞のアブレーションはGCaMP6s発現細胞よりも実行しやすいため、UAS:EGFPラインを使用してください。
- まず、研究対象の特定のニューロンとUAS:EGFPまたはUAShspzGCaMP6sをラベル付けするGal4ラインの嵌合を設定します。真珠層ホモ接合体を取得できるように、必ず両方の親に真珠層の背景を使用してください。
手記：真珠層のホモ接合体は、体表面にメラノフォアを含んでいません(図1B)。本研究では、Gal4系統のgSAIzGFFM119B(pretectumを標識する)と別のGal4系統hspGFFDMC76A(ILHを標識する)を使用する。
- 交配セットアップの翌日に、ゼブラフィッシュの卵を採取し、幼虫の段階まで育てます。その時点で、目的のニューロンが蛍光レポーターを発現します。
- ゼブラフィッシュの幼生を2%低融点アガロースにマウントします(図1B)。
- まず、2%アガロース原液を調製します:2 gの低融点アガロース粉末を100 mLシステム水(つまり、ゼブラフィッシュの成魚を循環水系で維持するために使用される水)またはE3水に溶かし、水をマイクロ波で沸点まで加熱し、激しく混合します。
- 2%の低融点アガロースストックを沸騰するまで電子レンジで加熱します。3.5〜4.0mLのアガロースを6cmのシャーレの蓋に注ぎます。アガロースが冷えるまで待って、触ると温かくなってから先に進みます。
- 次に、1匹の幼虫(このステップでは麻酔をかけていない)をアガロースに入れます。アガロースが固化して幼虫の適切な位置を確保するまで、解剖針(図1C)を使用して、幼虫の位置と向きを直立するように調整し続けます><。
手記：幼虫は、アガロースが固まる間、泳ぎ続けます。
- 幼虫が配置されたら、アガロースが完全に固まるまで5分間待ちます。
- 5 mLのトリカイン溶液(1x使用濃度で0.4%)をアガロースに注ぎます.
手記：レーザーアブレーション中の幼虫の動きを避けるために、アブレーション手順全体を通して幼虫を麻酔し続けなければなりません。
- 2光子レーザー顕微鏡システムの漂白機能を使用して幼虫をアブレーションします。
- アガロースに埋め込まれた幼虫を2光子レーザー走査型顕微鏡の下に置き、顕微鏡システムを起動します。
- 画像取得ソフトウェアを起動し、[レーザー]タブの[オン]ボタンをクリックしてレーザーをオンにします(図1D)。レーザーの「ステータス」が「ビジー」から「モードロック」に変わるのを待ちます。
- 「チャンネル」タブで、レーザーの波長をEGFPアブレーションの場合は880nm(最大出力:約2,300mW)、GCaMPアブレーションの場合は800nm(最大出力:約2,600mW)に設定します。
- 20倍対物レンズを選択するには、レンズリボルバーを手動で動かします。「検索」タブをクリックし、「GFP」をクリックして光路を変更し、蛍光を目で直接表示します。
- ゼブラフィッシュの幼生の脳を視界の中心に位置づけ、「Acquisition」タブをクリックして2光子顕微鏡に戻ります。
- 「アブレーション前」の状態の記録として、20倍の対物レンズで高速スキャンでzスタック画像を撮影します(熱による損傷を避けるため)。後で、アブレーション実験の前後に撮影した画像を比較します(図2A)。zスタックを取得するには、[Zスタック]をクリックしてzスタックオプションを選択し、タブを展開します。幼虫の脳の腹側端に焦点を絞った後に下限を設定し(「Set First」ボタンをクリック)、脳の背側最表面に焦点を絞った後に上限を設定します(「Set Last」ボタンをクリック)。次に、「実験を開始」ボタンをクリックして、z-stack画像取得を実行します。
- 63X対物レンズを選択するには、レンズリボルバーを手動で動かします。
- 「Locate」タブをクリックして落射蛍光顕微鏡に切り替え、目視でアブレーションする細胞を視界の中心で特定し、「Acquisition」タブをクリックしてレーザー走査型顕微鏡に戻ります。
- 「Acquisition Mode」タブで、「Frame Size」を256 x 256に設定します。「Live」をクリックして、目的のニューロンを観察します。
- 最も背側から始めて、アブレーションする細胞が焦点を合わせている焦点面を見つけます。
- 「Regions」関数を使用して、各ニューロンの直径の細胞サイズの約3分の1の小さな円形領域を関心領域(ROI)としてマークします。
- スキャン速度を13.93 s/256 x 256ピクセル(134.42 μm x 134.42 μm)に設定し、これは約200 μs/ピクセル、つまり200 μs/0.5 μmのレーザー滞留時間に相当します。また、4回の繰り返しを設定します(「反復サイクル:4」)。または、十分なアブレーションが達成されるように、反復回数とスキャン速度を最適化します。
- アブレーションの「漂白」機能を実行し、「時系列(2サイクル)」と組み合わせてサンプルを画像化します(アブレーション前後)および「領域」(ROIを設定するため)または使用するソフトウェアの同等の機能（図1D)。
- 時系列サイクルの最初の画像(アブレーション前)と2番目の画像(アブレーション後)を比較することにより、漂白後、標的細胞の蛍光がバックグラウンドレベルで観察されたものまで減少することを確認します(図2B)。
- アブレーション後も蛍光が残っている場合は、反復回数を増やします。
- 次に、焦点面を少し深く(つまり、腹側に向かって)移動させ、アブレーションされていない細胞が現れる次の焦点面を選択します。
- 上記のように漂白機能を実行します(ステップ1.9)。目的の神経構造内のすべての細胞がアブレーションされるまで、これらの手順を繰り返します。
- アブレーションする神経構造を覆うすべての焦点面を通過した後、細胞が消失した蛍光を確認します。アブレーションが不十分なために一部の細胞がまだ蛍光性であることがわかった場合は、上記のように再度レーザー照射してください。
- レーザー照射後に幼虫をアガロースから回収する必要がある場合は、幼虫に損傷を与える可能性があるため、アガロースから無理に引き出そうとしないでください。代わりに、幼虫の周りのアガロースに体の表面に対して垂直に小さな切り込みを慎重に作ります。次に、麻酔薬が切れたときに幼虫が自然にアガロースから泳ぎ出すのを待ちます。
- アブレーションのために次の幼虫に進むか、調査中の行動に関与していない別のニューロン集団を使用して制御実験を行います。
手記：ここでは、コントロールとして、UAS:EGFPの嗅球ニューロン;gSAIzGFFM119B幼虫は、上記と同じプロトコルを使用してレーザーアブレーションされました(図2A、右)。
- 回復に数時間または1日かかると、Caイメージング(セクション2)または行動記録(セクション3)に進みます。この回復期間中、幼虫の健康状態(つまり、通常の自泳、切除された領域の周囲に明らかな熱による損傷がないなど)を確認し、健康状態が悪い兆候を示している幼虫を取り除きます。
2. Pretectum-ablatedゼブラフィッシュ幼生における獲物誘発ニューロン活動を記録するためのカルシウムイメージング
- 記録室を作製するには、接着面をガラスに向け、セキュアシールハイブリダイゼーションチャンバーガスケットをスライドガラス上に置き、上部シールを剥がします
手記：これにより、直径9mm、奥行き0.8mmの小さな記録チャンバーが作成されます(図3A)。
- 次に、底部を切った50mLのチューブにナイロンメッシュ(開口部サイズ:32μm)をセットします。キャップを使用してメッシュをチューブに取り付けます(図3B)。
- ゾウリムシ(幼虫の視覚刺激として使用される獲物)を準備します
手記：事前にゾウリムシの培養物を準備します(手順2.3.1および2.3.2)。
- 事前に商業供給源または学術バイオリソースセンターからゾウリムシ種子培養を入手してください。
- ゾウリムシを、オートクレーブ処理した稲わらと乾燥ビール酵母のペレットを含む水で数日間培養します(図3C)。
- ゾウリムシ培養物を2つのふるい(1つは150μmの開口部、次にもう1つは75μmの開口部)に連続して注ぎ、培養物から破片を取り除きます。
- ナイロンメッシュ(13μmの開口部)上の前のステップからのフロースルーでゾウリムシを収集します。
- システム水のスクイーズボトルを使用して、ナイロンメッシュ上のゾウリムシをガラスビーカーに再懸濁します(図3D)。
- メッシュ(図3B)をシステム水2x(図3E)ですすいでください
手記：このステップの目的は、ゾウリムシ培地に含まれる可能性のある臭気物質と味を取り除くことであり、本研究の目標は視覚的に駆動されるニューロン活動を観察することです。
- ゼブラフィッシュの幼生をトリカイン溶液に入れて麻酔をかけます。
- 1匹の幼虫を2%低融点アガロースにマウントします。
- まず、2%の低融点アガロースを電子レンジで加熱し、10倍濃縮トリカインの1/10容量をアガロースに加えます。
- トリカイン含有アガロースを1滴記録チャンバーに置きます(図3A)。
- アガロースが熱すぎないことを確認した後、麻酔をかけた幼虫(ステップ2.5から)をアガロースに入れ、すぐに余分なアガロースを取り除き、アガロースの表面がわずかに凸状に見えるようにします。
- 解剖針で幼虫をすばやく直立位置に向けます(図1C).
手記：これらの手順は、アガロースが固化する前に数秒以内に完了する必要があります。
- 幼虫が適切に配置されたら、アガロースが完全に固まるまで5分間待ちます。次に、アガロースに1xトリカイン溶液を一滴注ぎます。
- ゼブラフィッシュの幼生の頭の周りのアガロースを取り除き、ゾウリムシが外科用ナイフを使って泳ぐためのスペースを作ります。これを行うには、まず、アガロースにいくつかの小さな切り込みを入れます(図3F)。次に、チャンバーにシステム水を静かに注いで、余分なアガロースを慎重に取り除きます
手記：このステップで、トリカインは洗い流されます。
- 次に、記録室にゾウリムシを1つ入れて視覚刺激として使用します
手記：ゾウリムシがゼブラフィッシュの幼生の頭の近くを泳ぐと、ニューロン反応が引き起こされます(図3G)。
- 科学用CMOSカメラを搭載した落射蛍光顕微鏡の下に記録チャンバーを置き(図3H)、2.5倍の対物レンズを選択します(図3I)。
- GCaMP蛍光信号のタイムラプス記録を収集します。
- 搭載カメラの画像取得アプリケーションを起動します。
- 「シーケンスペイン」をクリックし、ペインで「ハードディスクレコード」を選択します。[スキャン設定]セクションで、[フレーム数]を900またはその他の必要な合計フレーム番号に設定します。
手記：可能な場合は、データをハードドライブに効率的に保存できるモジュール(ここでは「ハードディスクレコード」)を備えたタイムラプス録画ソフトウェアを使用してください。
- [キャプチャ] ウィンドウで、露出時間を 30 ミリ秒 (つまり 33.3 fps) に設定し、ビニングを 2 x 2 に設定します。
- 顕微鏡制御タッチパネルで、GCaMPはGFPと同様の励起/発光スペクトルを持つため、GFP用のフィルターセットを選択します。
- キャプチャペインの[Live]をクリックして、カメラビューとフォーカスで幼虫を見つけ(図4A)、[Stop Live]をクリックして[Start]ボタンをクリックします。ムービーは、.cxdまたは取得条件に関する情報を保持するその他の形式で保存します。
