全細胞パッチクランプを用いた蛍光ニューロンの興奮性の研究

要約

出典:Briz, C. G., et al., 神経亜集団の興奮性と単一細胞接続性を研究するための子宮内エレクトロポレーションアプローチ。 J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオは、全細胞パッチ電流クランプを使用して、蛍光タンパク質を発現するニューロン細胞の興奮性を研究する方法を示しています。電流クランプモードでは、ニューロンの興奮性を示す活動電位が生成されます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 電気生理学

>注:このプロトコルの目的は、GFPエレクトロポレーションマウス脳(または以前にエレクトロポレーションされた他の蛍光タンパク質)におけるGFP発現によって視覚的に識別された層II/III錐体細胞ニューロンから全細胞電流クランプ記録を取得することです。このプロトコルを使用して、IUEによって導入された遺伝子改変がニューロンの電気的特性に及ぼす影響を研究することが可能です。特定の燃焼モードの獲得は、イオンチャネルの広範なレパートリーの動的発現を含む分化の段階的なプロセスであり、その結果、出生後の後期段階の前に一過性燃焼モードが発現します。例えば、P16より前の体性感覚マウス皮質のII/III層では、成熟した電気的応答は観察されません。

1. 急性スライスの前提条件
   1. 119 mM NaCl、26 mM NaHCO₃、11 mM グルコース、2.5 mM KCl、1.2 mM MgCl₂、2.5 mM CaCl₂、および 1 mM NaH₂PO₄ を含む高純度(二重蒸留水)を使用して ACSF 1 L を調製します。pHをHClまたはNaOHで7.3〜7.4に滴定します。浸透圧を290 mOsmに調整します。
   2. テフロンチューブ(~1 mm)を使用して15〜20分間、カルボゲン(95%O₂/5%CO₂)を含むACSFをバブル化し、pHを7.3〜7.4に安定させます。
2. 全細胞記録の前提条件
   1. 電気生理学ステーションには、記録チャンバー、灌流システム、顕微鏡、電極(記録、刺激、および接地)、マクロおよびマイクロマニピュレータ、硬質耐振動性テーブルトップおよびファラデーケージ、刺激装置、増幅器およびアナログ-デジタル(A / D)コンバータ、取得ソフトウェアを備えたコンピュータ、および遺伝子組み換えニューロンを分析するためのGFP(またはその他の蛍光色素)フィルタが装備されていることを確認してください(図1A)。
   2. 115 mMグルコン酸カリウム、2 mM MgCl₂、10 mM HEPES、20 mM KCl、4 mM Na₂ATP、および0.3 mM Na₃GTPを含む細胞内溶液を調製し、KOHでpH 7.2、KClで290 mOsmに調整します。
   3. ホウケイ酸ガラスのキャピラリーを引っ張ってパッチピペットを作ります。マイクロピペットプーラーを使用してパッチ電極を調製します。ホウケイ酸キャピラリー(外径1.5mm、内径0.86mm、長さ10cm)を使用します。細胞内溶液を充填すると3〜10MΩの抵抗を示すパッチ電極を作成します。
   4. 記録チャンバーをACSFで2 mL/分の速度で灌流し、チャンバーの温度を約33°Cに保ちます。
3. 全細胞記録
   1. パスツールピペット(長い先端を切り取る)または小さなブラシを使用して、スライスを記録チャンバーに移します。ハープでスライスを押し続けます。スライスをACSFで2mL/minの速度で絶えず灌流します。
   2. GFP陽性ニューロンにパッチを当てます。
      1. スライスを記録チャンバーに入れ、顕微鏡で低倍率(10倍)で対象領域を見つけます。次に、60x対物レンズを使用してパッチするGFP陽性細胞を見つけます。
      2. 記録電極に細胞内溶液を充填します。フィルター(4mmフィルター)に連結したシリンジとマイクロローダーチップを使用して、記録電極に細胞内溶液を充填します。
      3. ガラスピペットをピペットホルダーに入れます。ピペットチップをバスに入れ、チップに焦点を合わせます。ピペットが浴に入ったら、背圧制御システムを通じて陽圧を加えます。
      4. 蛍光性のニューロンにパッチを当てます(図1B)。
         1. ピペット内の背圧を維持しながら、目視ガイドの下で目的の細胞にアプローチします。細胞表面に小さなくぼみが現れたら、圧力を解放します。この時点で、タイトシール(抵抗が1GΩより大きい)が形成される場合があります。それ以外の場合は、軽い負圧(吸引)を加えて促進します。
         2. シールが形成されている間に、保持電圧クランプを-60mVにします。GΩシールが形成されたら、吸引パルスを印加してピペットの下の細胞膜を破裂させ、全細胞モードに入ります。
      5. 電流クランプ条件を使用してアクティビティを記録します。全セルモードになったら、電圧クランプモードから電流クランプモードに切り替えて録音を開始します。例えば、細胞の興奮性を記録するには、500 ms長の脱分極電流注入(100 - 400 pA)を適用します。
         1. 入力電流を増加させるための列車に沿った活動電位の数をプロットして、発火率を計算します。
            手記： 静止膜電位、入力抵抗、および膜容量も記録から計算できます。

結果

図 1.電気生理学の設定と発火反応の例。A. 写真は、急性スライスのパッチクランプ実験に用いた電気生理学的なセットアップを示しています。セットアップはノイズを排除するためにファラデーケージに含まれており、機器は防振テーブルの上にあります。電極用の電動マイクロマニピュレータのコントローラを左側に示します。B. GFPでエレクトロポレーションしたマウスの錐体ニューロンを明視野および緑色蛍光条件下で観察。GFP+セルに取り付けられた記録ピペットが目立ちます。スケールバー = 10 μm. C.典型的な規則的なスパイク応答を示すCAG-GFPエレクトロポレーション制御層II-IIIニューロンの発火パターン。活動電位の分布は、入力電流の持続時間(X軸)に沿った規則的な分布...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ホウケイ酸ガラスキャピラリー(100mm、1.0 / 0.58外径/内径)	株式会社プレシジョンインストゥルメント	1B100F-4
校正済みマイクロキャピラリーピペット用のアスピレーターチューブアセンブリ	シグマ - アルドリッチ	A5177-5EA
蔗糖	シグマ - アルドリッチ	S0389
蛍光イメージング用顕微鏡 - MZ10F	ライカ
Axiovert 200 マイクロスコープ	ツァイス
P-97 マイクロペットプーラー	サッターインストゥルメントカンパニー	P-97
パッチクランプ解析ソフト(p-Clamp Clampfit 10.3)	分子デバイス	-
アクイジションソフトウェア(MultiClamp 700B Amplifier)	分子デバイス	DD1440A
電動マイクロマニピュレーター+回転ベース	サッターインストゥルメント	MP-225
エアテーブル	ニューポート	-
ミニチュア蠕動ポンプ	WPIの

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