微小電極アレイを用いた新生児仔の麻酔下での脳グルタミン酸濃度の測定

要約

出典:Geyer, E. D., et al. Adaptation of Microelectrode Array Technology for the Study of Anesthesia-induced Neurotoxicity in the Intact Piglet Brain. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、微小電極アレイ(MEA)を使用して、麻酔をかけた新生児の子豚の脳内のグルタミン酸レベルを測定する方法を示しています。この手順では、ブタの頭蓋骨に開頭窓を作成し、MEAを関心のある脳領域に挿入します。MEAのグルタミン酸オキシダーゼでコーティングされた記録部位は、細胞外の脳グルタミン酸を過酸化水素に変換し、測定可能な電流を生成します。この電流は、麻酔下での脳のグルタミン酸レベルを決定するために、バックグラウンドノイズに対して測定および正規化されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 子豚と子豚の取り扱い

1. ARRIVEガイドラインに従って、潜在的な性別に基づく交絡因子を排除するために、体系的かつ無作為化された方法で雄と雌の子豚を利用します><。 注:脳の最大成長期間は子豚の出生から3〜5日以内であるため、実験は生後3〜5日の子豚のみで行われます。
2. 子豚が実験の少なくとも24時間前にビバリウムに到着し、環境に順応できるようにしてください
   手記：訓練を受けた獣医スタッフが日常的な動物の世話をします。子豚は、個別に温度管理され、継続的に監視されたケージで飼育され、低血糖を防ぐために栄養的に完全な代用乳を自由に投与されます。子豚はまた、麻酔の少なくとも3時間前に、ミルクの代替品なしで(osあたりゼロ)飼われ、正常なレベルの刺激を確保するために毛布とおもちゃが供給されます。可能であれば、社会化を可能にするために、複数の子豚を同じケージに入れてください。

2. 子豚モデルにおける麻酔誘発神経毒性(AIN)研究のための微小電極アレイ(MEA)の開発とカスタマイズ

>注:この技術は、酵素で事前にコーティングされ、m-フェニレンジアミン二塩酸塩(mPD)で電気メッキされた酵素ベースのMEAを使用します。電極は40mmの剛性シャフトでカスタム設計され、子豚用に製造されました(図1)。

1. MEAの調製とキャリブレーションの詳細な説明(図2)を参照してください。

>3. 子豚の麻酔と特製定位固定装置の使用

1. 適切な人工呼吸器とモニタリング装置を備えた麻酔ワークステーションを使用して動物に麻酔をかけ、パルスオキシメトリー、非侵襲的血圧、心電図、体温などの生理学的パラメータを前述のように実験全体を通してモニターします。子豚に挿管して換気し、セボフルラン麻酔を 1 つの最小肺胞濃度 (MAC) (約 2.5-3%) で 3.5 時間投与します。これらの実験には、訓練を受けたラボスタッフが立ち会うようにしてください。手術部位を覆う毛皮は、皮膚の準備前に電動バリカンを使用して除去されます.
   手記：使用される麻酔薬の濃度と持続時間により、実験は外科的処置中の実際の麻酔曝露の時間-長さをシミュレートできます。さらに、セボフルランは小児集団で最も一般的に利用されている全身麻酔薬であり、その安全性を取り巻く調査が最も重要になっています。
2. 脳定位固定装置フレームに留置する前に、2.5 mg / kgのロクロニウム負荷量と1.5 mg / kg / hの注入を開始し、フレームに固定された状態で動物が動くのを防ぎます。.
   1. つま先をつまんで十分な麻酔の深さを確認したら、子豚を子豚専用の定位固定装置フレームに置きます。
   2. 子豚を強制空気加温パッドの上に置くことにより、定位固定フレーム内に適切なパッドを提供し、褥瘡を防ぐために追加のパッド(例:流動ポジショナー)を提供します。
   3. 上顎骨の歯を歯のバーの上に置きます(図3).
      手記： 歯のバーは、頭蓋骨を非常にしっかりと固定するのに十分なレベルにある必要があります。
   4. 子豚が正中線の位置にあることを確認しながら、貫通するイヤーバーを耳の内側に固定して締めます。ラテラルホールドの尖った先端を外耳道内に配置し、鼓膜の浸透に関連する「ポップ」音が聞こえるようにイヤーバーを十分にしっかりと挿入します。実験中の頭蓋骨の動きを防ぐために、イヤーバーを頭蓋骨にしっかりと取り付け、両側に等しい深さに挿入します(図4、パネルA).
      手記：子豚を暖かく保ち(~37.8-38.6°C)、常温症の維持のために全手順で温度を継続的に監視することが非常に重要です。これは、毛布やヒートランプを介して実現できます。ヒートランプは必ず適切な距離に置いてくださいamp動物の皮膚の火傷を避けるために。
3. メスで頭蓋骨を傷つけないように注意して、頭蓋骨に沿って4〜6cmの正中線切開を作成します。切開が完了したら、穏やかな収縮と鈍い解剖を使用して、頭蓋骨から頭皮を持ち上げます。ガーゼパッドで頭蓋骨をやさしくこすり、結合組織を取り除き、縫合線を露出させます(図4、パネルB).
   手記：非生存実験中に無菌性を維持する必要はありません。ただし、生存実験中は無菌性を維持する必要があります。
4. 必要に応じて、頭皮をさらに反射させて、関心領域を露出させ、開頭術の意図された位置を決定します(図5、パネルA)。外科用ドリルを使用して、硬膜やその下にある脳を傷つけないように注意しながら、目的の構造を覆う約0.25 cm²(実験目標に応じて大きくも小さくも)の開頭窓を作成します(図5、パネルB)。細かい手術用ハサミを使用して、脳組織を覆う硬膜を切除します(図5、パネルC)。
5. ヘッドステージの金属アームを子豚ステレオタックスのマイクロマニピュレーターに固定することにより、電極をブレグマ上でできるだけ垂直に配置します。頭蓋骨の表面に触れないように、電極をできるだけ下げます。ブレグマの座標を記録します(図6、パネルA)。
   1. 前後座標と内側外側の座標、およびブレグマに関連する対象の構造の深さを決定します。種と年齢に適した定位アトラスを使用して定位固定装置の座標を決定します。この場合、子豚用に特別に開発された定位固定装置アトラスを使用してください。
   2. 電極の位置を変更して、電極が適切な前後および内側外側の位置を持つようにし、微小電極と装置の両方が表面に対して垂直になるようにします。疑似参照電極を頭皮の下に置き、動物との接触を確保します(図6、パネルB)。
   3. ゆっくりと穏やかに、脳定位アームを使用して電極を脳の適切な深さまで下げます。最後の2 mmについては、油圧マイクロドライブを使用して、電極をさらに正確な位置に駆動します(図6、パネルC).
      手記：電極の位置は、開頭術の窓を覆う必要があります。電極の深さは、対象の脳の構造によって異なります。非生存実験では、データ収集の完了時に切開部を閉じる必要はありません。

4. セボフルラン麻酔下での細胞外グルタミン酸の測定

1. この手順全体を通して、子豚が継続的な生理学的モニタリング下にあることを確認してください。子豚は、手順の準備として吸入的に(フェイスコーンを介して)麻酔されます。
2. MEAの埋め込み後、電極がベースラインに達するまで30分待ってから、3時間で正しい測定値が得られることを確認します(図7)。
3. 0.25% ブピバカイン (1 mL/kg) は、術後の疼痛管理のために手術部位に皮下投与されます。さらに、徐放性ブプレノルフィンは、必要に応じてq72h皮下投与されます。.

結果

図1:SG-2微小電極アレイの種類の視覚的比較。SG-2アレイには、2つのグルタミン酸感受性部位と2つのグルタミン酸非感受性センチネル部位(150 μm x 20 μm/部位)が含まれています。(A)左にフレキシブルシャフト微小電極アレイを示します。リジッドシャフト微小電極アレイは、子豚で使用するためにカスタム設計されており、大型動物へのより深い移植を可能にします。

図2:微小電極アレイの調製とキャリブレーションプロセスの概要。MEAの準備と校正の合計は約1週間続き...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アドバンスリキウィーン豚用ミルク代替品	PBSアニマルヘルス
子豚麻酔フェイスコーンマスク	ベトエキップ
Integra SL麻酔ワークステーション	DRE獣医		この麻酔ワークステーションは、手術室で小児患者が経験する臨床モニタリングを最もよく模倣するように選択されています。十分な生理学的モニタリングと介入が可能な状態であれば、どんな麻酔器でも使用することができます。
セボフルラン	ウルタン	0074-4456-04
臭化ロクロニウム注射。	ホスピーラ	0409-9558-05
Medfusion 4000 IVインフュージョン	スミスメディカル
モデル1530 ヘビーデューティー研究モデル ステレオタックス	コップフ		カスタムメイド
モデル1541子豚アダプター	コップフ		カスタムメイド
赤外線スポットランプ	アマゾン	B000HHQ94C
ベアハガートルソブランケット	3メートル	540
ベアハガー	3メートル	750
滅菌アルコール調製パッド	フィッシャーブランド	22-363-750
炭素鋼リブバック外科 刃	バードパーカー	#10
メスヘンデル	ハヴェルの	ハンG4
手術用ハサミ	世界の精密機器	504615
蚊の鉗子	Sklar手術器具	17-1225
ガーゼパッド	フィッシャーブランド	22-246-069
Adson 組織鉗子	テレフレックス	181223
ドレメル111彫刻カッター	アマゾン	ドレメル111
微小電極アレイ	ケンタッキー大学マイクロエレクトルドー技術センター		S2 4Ch MEA; カスタムメイド
ヘッドステージ	クアンテオン		2pA/mV
ワイヤー、銀、PFA、.008インチ裸、.0110インチコーティング	A-Mシステムズ	786500
ファインマイクロマニピュレーター	成重科学機器研究室	モ-8

名 名