貫通微小電極アレイを用いた展開した海馬組織の神経活動の記録

要約

出典:Zhang, M., et al.浸透性微小電極アレイを用いた展開海馬製剤における神経活動の伝播。J. Vis. Exp.(2015年)。

このビデオは、展開した海馬からの神経信号を捕捉するために、貫通型微小電極アレイ(PMEA)を備えた記録チャンバーを設定する手順を示しています。この方法により、展開した海馬内の神経活動の伝播速度と方向をin vitroで調べることができます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査によってレビューされ、承認されています。

1. 手術と実験記録のための解決策

1. (mM)NaCl(塩化ナトリウム)124、KCl(塩化カリウム)3.75、_KH2PO4(リン酸二水素カリウム)1.25、MgSO4(硫酸マグネシウム)2、NaHCO3(重炭酸ナトリウム)26、デキストロース10、および_CaCl2(塩化カルシウム)2を含む正常な人工脳脊髄液(aCSF)緩衝液を調製する。この正常なaCSFは、解剖後の組織回収および実験開始時の洗浄システムに使用します。
2. 海馬解剖中に使用され、(mM)を含むスクロースaCSFを準備します:スクロース220、KCl 2.95、NaH₂PO₄(リン酸二水素ナトリウム)1.3、MgSO₄ 2、NaHCO₃ 26、デキストロース10、およびCaCl₂ 2。無傷の海馬組織調製物でてんかん様活性を誘導するために、4-アミノピリジン(4-AP)を100μMの濃度で正常なaCSFに添加します。

2. 展開した海馬を透過性微小電極アレイ(PMEA)に載せて神経活動を記録する

1. 実験セットアップを準備するには、1 本のボトルに正常な aCSF を充填し、もう 1 本のボトルに 4-AP aCSF を充填します。両方のボトルで、各実験の最初から95%O₂/5%CO₂を泡立てます。トライバルブコネクタを使用して、実験中に選択される溶液を制御します。チャンバーの出口に真空管を接続して、溶液をダストコンテナにポンプで送り込みます。パイプラインを加熱してから記録チャンバーに供給し、溶液を制御された温度レベル(35°C)に保ちます。
2. 記録チャンバーの入口と出口が閉じたら、カスタムメイドのガラス製ピペットスポイトを使用して、展開した海馬をチャンバーに移して配置します。顕微鏡下で、組織が溶液中に浮いている間に、通常の小さなペイントブラシを使用して、展開した海馬を配置します。展開した海馬を、肺胞側を下に向けて、CA3領域を反対側に、CA1フィールドを研究者に向けて配置します。
3. 記録チャンバーの端から真空ピペットを使用してチャンバー内の溶液を慎重に吸い取り、チャンバーが乾燥して組織がアレイ上に下がるまで溶液レベルを下げます。次に、カスタムメイドのティッシュアンカー(図1)(Specific Materials and EquipmentのNo.7)を組織の上に慎重に置き、展開した海馬をアレイに保持します。記録室に数滴の溶液を入れて補充し、入口と出口を徐々に開いて、IVドリップチャンバー内の流量を毎秒約2滴に調整します。
4. 記録チャンバー内の組織を正常なaCSFと約1分間インキュベートして回復させた後、溶液の供給を4-AP溶解したaCSFに切り替えて、流量を適切に調整します。4-AP溶解したaCSFで組織を約5〜10分間インキュベートし、その後、研究者は自発的な活動が現れたときにソフトウェアを起動してシグナルを記録できます。

結果

図 1.実験的なセットアップ。(A)ネジ付きのプラスチック製カバー蓋が回路の上に配置され、水害の可能性から保護します。記録チャンバーには、溶液の流れを運ぶための入口管と出口管の両方があります。実験中に組織を固定するために、ナイロン繊維メッシュで接着されたカスタムメイドのティッシュアンカーが使用されます。 (B)PMEAのガラス基板の底面から撮影した写真で、実験中にサンプルスライスを保持している組織アンカーを示しています。湾曲したワイヤーは、組織の上部に押し付けられたメッシュからのナイロン繊維です。丸い点は微小電極のベースです。矢印は、いくつかの実験で損傷した電極を示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
小さなペイントブラシ	ロウズ	tem #: 105657 モデル #: 90219	通常のペイントブラシのパッケージの中で最も小さいサイズです
磨かれたガラスのヘルプツールを火で磨く	該当なし	該当なし	このツールはファイヤーポリッシュされ、通常のパスツールガラスピペットから作られました。
カスタムメイドのガラス針	該当なし	該当なし	このツールはファイヤーポリッシュされ、通常のパスツールガラスピペットから作られました。
金属線ループ付きのカスタムメイドガラスツール	該当なし	該当なし	このツールはファイヤーポリッシュされ、通常のパスツールガラスピペットに形状を変更した金属ワイヤーループから作られました。
カスタムメイドのガラス溶液スポイト	該当なし	該当なし	このツールは、通常のパスツールガラスピペットから作られ、先端がカットされ、カットされた端にゴム製のヘッドが取り付けられています。
カスタムメイドティッシュアンカー	該当なし	該当なし	ナイロン繊維メッシュは、絶縁された銅線リングに接着されました。組織アンカーはマイクロマニピュレータによって保持されました。
カスタム作製微小電極アレイ	該当なし	該当なし	アレイの詳細については、Kibler, et al, 2011を参照してください。
アレイ用のカスタムメイドのフィルターとアンプ回路	該当なし	該当なし	アレイの詳細については、Kibler, et al, 2011を参照してください。
データ取得プロセッサ 3400a	マイクロスターラボラトリーズ	該当なし	A/Dコンバータを搭載した完全なデータ集録システムです。