電気生理学セットアップを使用して視覚経路の完全性を評価するためのラットモデルの準備

要約

出典:Nguyen, C. T. et al., 麻酔ラットにおける網膜電図と視覚誘発電位の同時記録。J. Vis. Exp. (2016年度)

このビデオは、網膜の健康と視覚経路の完全性を研究するためのラットモデルの準備を示しています。視覚誘発電位と網膜電図の参照および能動電極をラットに接続し、続いてプラットフォームをガンツフェルドボウルの前でラットに位置合わせして網膜照明を均一にし、ファラデーケージを閉じて外部干渉を回避します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 慢性視覚誘発電位(VEP)電極の埋め込み前

>注:網膜電図(ERG)とVEP信号を同時に収集する場合は、信号収集の少なくとも1週間前に動物にVEP電極を外科的に埋め込む必要があります。

1. 実験前にクロルヘキシジン(70%エタノール中0.5%)で洗浄することにより、手術台を滅菌します。使用前にすべての手術器具をオートクレーブで処理してください。滅菌された外科用ドレープで動物を覆います。すべての実験者がサージカルマスク、ガウン、滅菌手袋を着用していることを確認してください。
2. 3 L/minの流速でO₂が付いている3 - 3.5%のイソフルランの麻酔を誘発し、外科全期間1.5%および2 L/minで麻酔を維持する。足のピンチ反射がないため、十分な麻酔の深さを確保します。
3. 角膜に1%カルボキシメチルセルロースナトリウムを塗布して、目の乾燥を防ぎます。
4. 額の上、目の後部と耳の前方に30 mm x 30 mmの領域を剃ります。
5. 動物をヒートパッド(37°C)に置き、体温を維持し、定位固定装置フレームで動物の頭を安定させます。
6. 剃った部分を10%ポビドンヨードで3回消毒します。目の近くの領域については、外科技術者協会によって定められた標準治療と一致するアルコールベースの消毒剤の使用を避けてください。
7. メスで頭の中央矢状切開を行い、この切除から真皮組織の直径 20 mm ~ 20 mm の円を描き、頭蓋骨を露出させます。
8. ガーゼでこすり落として乾燥させることにより、冠状および矢状頭蓋縫合糸を露出させることにより、下にある骨膜を切除します。
9. ドリルに取り付けられた歯科用バリを使用して、固定装置座標(尾側からブレグマまで7mm、正中線から横方向3mm)で両半球の頭蓋骨に2つの穴(直径0.7mm、深さ~1mm)をトレパンします。
10. ステンレス鋼のネジ(直径0.7 mm、長さ3 mm、クロルヘキシジンで滅菌)を、深さ~1 mm(ネジの2 mmが露出している)までの2つの既製の穴にねじ込み、しっかりと固定できるようにします。これは、下にある皮質組織を損傷することなく硬膜に接触します。
11. 頭蓋骨をガーゼで乾燥させ、~4時と8時の2本の3-0縫合糸で緩んだ皮膚を引っ込めて、歯科用アマルガムの手術領域を準備します。
12. 露出した頭蓋骨に歯科用アマルガムを広げて、ネジ電極(手順1.10で説明したステンレス鋼のネジ)を所定の位置に固定します。記録のために、~1.5mmのネジが露出したままであることを確認してください。
13. リトラクション縫合糸を取り外します。
14. 鎮痛のために0.5%カルプロフェンを皮下(5 mg / kg)に注入し、生理食塩水(塩化ナトリウム0.9%、1.5 ml)を水分補給のために皮下に注射します。.
15. 動物が別々のケージで回復できるようにします。動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。
16. 動物が手術から完全に回復するまで(最低5日間)、動物を他の動物の会社に戻さないでください。
17. 鎮痛のために0.5%カルプロフェン(5 mg / kg)を1日1回4日間皮下投与し続けます。.
18. 手術の1週間後にERGとVEPを記録します。

2. ERGとVEPの記録

1. データ収集の準備
   1. コンピュータソフトウェアを使用して、以下で推奨される設定に従って、刺激をトリガーし、データを取得するのを同時に行います。
      1. 信号(ERG:×1,000、VEP:x10,000)を、絶縁型プリアンプとアンプで内部設定し、両目をインピーダンスに合わせた状態で増幅します。
      2. 650ミリ秒の記録ウィンドウ(2,560ポイント)でERGのサンプリングレートを4 kHzに設定します。これを行うには、データ収集ソフトウェアの「タイムベース」のタブをクリックし(ソフトウェアの名前とバージョンについては、材料の表を参照)、サンプルに「2,560」を選択し、650ミリ秒の記録ウィンドウを返す時間には「500ミリ秒」を選択します。
         1. 同じ方法を使用して、VEP のサンプリング レートを 250 ミリ秒のエポックで 10 kHz に設定します。ERGとVEPの両方の記録に対して10ミリ秒の事前刺激ベースラインを許可します。これを行うには、「セットアップ」タブをクリックします。「Stimulator」を選択して、新しいダイアログウィンドウを表示します。そのウィンドウで、「モード」のドロップダウンリストから「パルス」を選択します。そして、「遅延」の値を「10ミリ秒」に設定します。
      3. ERG バンドパス フィルタリングを 0.3 から 1,000 Hz (-3 dB) に設定します。これは、データ収集ソフトウェアの「Bio Amplifier」をクリックすることで行います。次に、「High Pass」の値を「0.3Hz」に、「Low Pass」の値を「1kHz」に設定します。
      4. 上記の 2.1.1.3 の方法を使用して、ヒト VEP 記録の国際臨床電気生理学学会 (ISCEV) が推奨しているように、VEP バンドパス設定を 0.1 - 100 Hz (-3 dB) に設定します。

2. 電極の準備

1. ERGアクティブ/非アクティブ電極とVEPアクティブ/非アクティブ電極をカスタムメイドするには、銀線またはワニ口クリップを電極リードにそれぞれ取り付けます。接地電極を商業的に入手します。
2. 4つのカスタムメイド電極の場合、電極リードエクステンションからオス端を切り取ります。外側のポリテトラフルオロエチレン絶縁コーティングをメスの刃で1cm取り外し、内側のワイヤーが損傷しないようにします。
3. 長さ70mmの銀線(厚さ0.3mm)を切断し、直径~8mmのループを形成してラットの目を取り囲むことにより、ERG非アクティブ電極を事前に作成します。1mlのピペットチップでループを形作って、均一な円を準備します。
4. 70 mmの長さの銀を切断し、縦の直径で楕円~8 mmを形成してラットの切歯に引っ掛けることにより、VEP非アクティブ電極を事前に作成しました。
5. 長さ30mmの銀線を切断し、ラットの角膜(直径1~2mm)に優しく接触する小さなループを形成することにより、ERGアクティブ電極を事前に形成
します
6. 露出したインナーワイヤーに銀を絡ませて、電極(2つのERGアクティブ、2つのERG非アクティブ、1つのVEP非アクティブ)を電極リードにしっかりと取り付けます。
7. 露出した余分な金属をマスキングテープで断熱して、太陽光発電のアーチファクトを減らします。
8. ERGの非アクティブ電極に、マスキングテープに面ファスナー(~5mm×20mm)を貼り付けることで、ネズミのネックストラップに安定して取り付けることができます。
9. ワニ口クリップを電極リード線の内側のワイヤーに取り付けて、VEPアクティブ電極を作成します。
10. 記録に先立ち、銀線の露出面(すなわち、非アクティブリングとアクティブチップ)を9V DCソースを使用して塩化物で20秒間電気メッキし、信号伝導を改善します。
    1. これを行うには、ERG電極ワイヤーの銀色の先端(一次電池のアノードとして機能する)を生理食塩水に浸し、この電極ワイヤーのもう一方の端を9Vバッテリーのプラス端子に接続します。
    2. 別のワイヤー(カソード)をバッテリーのマイナス端子に接続し、もう一方の端も生理食塩水に浸します。20秒後に外し、ERG電極ワイヤーの銀色の先端が白色に均一にコーティングされるのを観察します.
       注:塩化物コーティングの開存性を確保するために、実験セッションごと(~最大8時間)ごとに新しいERG電極を準備します。

3. 動物の調理法

1. 動物を一晩(≥8時間)暗く適応させてから、光の当たらない部屋で録音します。部屋の照明を消し、すべてのドアとブラインドを閉めることにより、最大限の暗順応を確保します。ドアや窓の接合部の周りに遮光材を配置し、厚い黒いカーテンの外側にコンピューター画面を配置することで、光漏れを最小限に抑えます。
桿体感度を維持するために、
2. 薄暗い赤色発光ダイオード(LED;17.4 cd.m-2、λ_max = 600 nm)を使用して、暗い部屋で動物の準備を行います。
3. ケタミン/キシラジン(60:5 mg / kg)を筋肉内に注射してラットに麻酔をかけます。.足のつまみ反射がないため、十分な麻酔の深さを確認します。
4. 鎮静を維持するために、必要に応じて50分後にさらに麻酔(初期用量の50%)を投与します。.
5. 追加の局所麻酔では、0.5%プロキシメタカインを各眼に1滴塗布し、余分な水分をまばたきで取ります。.
6. 瞳孔拡張の場合は、0.5%トロピカミドを各眼に1滴塗布し、余分な水分を乾かします。

>4. ERGおよびVEP電極の位置決め

1. ファラデーケージにあるガンツフェルドボウルの前のERGプラットフォームに動物を置きます。電気加熱パッドは、電気生理学的記録に電気ノイズを導入する可能性があるため、使用しないでください。
   注意: プラットフォームは、体温を維持するために循環温水プラットフォームに取り付けられています。
2. 面ファスナーのストリップをうなじの周りにしっかりと配置して、動物をプラットフォームに固定します。
3. 麻酔をかけたラットの下切歯の周りに不活性なVEP電極を引っ掛けます。
4. ERGの不活性電極を、眼の赤道の周囲に非侵襲的に強膜リングを囲むように配置します。うなじの周りの面ファスナーストリップに電極を取り付けて、これを安定させます。反対側の目についても繰り返します。
5. 頭蓋骨にあらかじめ埋め込まれたステンレス製のネジにワニ口クリップを取り付けて、VEPアクティブ電極を固定します。
6. ERGアクティブ電極を配置する前に、角膜に1%カルボキシメチルセルロースナトリウムを少量滴下して、信号品質を改善します
   注:ビスコース液は、げっ歯類の乾燥型白内障の形成を最小限に抑えるために、実験中に角膜の水分補給を維持するのにも役立ちます。
7. 1%カルボキシメチルセルロースナトリウムを下部切歯に少量滴下して、VEP不活性電極の接触を改善し、信号品質を改善します。
8. ERGアクティブ電極を、特注の定位固定アームに取り付けられたマイクロマニピュレーターを使用して、角膜中央表面に軽く触れるように配置します。
9. 2〜5mmの接地針電極(ステンレス鋼)をテールに皮下に挿入します。
10. 必要に応じて、録音前に下まぶたから余分な液体を乾かして、信号品質を改善します。
11. プラットフォームをガンツフェルドボウルに近づけてスライドさせ、動物の目がボウルの開口部と揃うようにして、両方の網膜を均一に照らすことができます(ステップ2.4.1を参照)。
12. ファラデーケージを閉じて、異音を減らします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ワニ口クリップ	ジェネリックブランド	HM3022	VEPネジ電極をケーブルに接続するためのステンレス製26mmクリップ
バイオアンプ	ADInstruments	ML 135	ERGおよびVEP信号の増幅用
カルボキシメチルセルロースナトリウム1.0%	アラガン	CASの0009000-11-7	アクティブERG電極の信号品質を向上させるための粘性流体
カルプロフェン 0.5%	ファイザー・アニマルヘルス・グループ	CASの53716-49-7	独自の名前:リマジル注射剤(50 mg / mL)。術後鎮痛のために、生理食塩水で0.5%(5 mg / mL)に希釈してください
クロルヘキサジン0.5%	オリオン研究所	27411、80085	手術器具の消毒に
循環水浴	ラウダ・ケーニヒスホッフェン	MGWラウダ	手術中の麻酔動物の体温維持および電気生理学的記録
歯科用アマルガム	デギュデントGmbH	64020024	電極-頭蓋骨アセンブリを包み込み、より頑丈にします
歯科用バリ	ストルツ・インスツルメンツ社、ボシュ・ロム	#E0824A	直径~0.7mmのミニチュアドリルヘッドで、各半球の頭蓋骨に小さな穴を開けてVEPネジを埋め込み
ドリル	ボッシュ	ドレメル300シリーズ	トレパニング用自動ドリル
電極リード	グラステレファクター	F-E2-30	銀線電極をアンプに接続するためのプラチナケーブル
ファラデーケージ	オーダーメイド		暗順応を維持するために耐光性を確保します。Ganzfeldセットアップを同封して、信号対雑音比を改善します
ガーゼ綿棒	マルチゲートメディカルプロダクツPty株式会社	57-100バート	手術中に外科的切開部と露出した頭蓋骨表面を乾燥させるため
ガンツフェルド積分球	フォトメトリック・ソリューションズ・インターナショナル		カスタム設計の光刺激装置:直径36 mm、開口部サイズ13 cm
VELCRO	ベルクロオーストラリアPty Ltd	ベルクロブランド再利用可能なラップ	電極と動物を記録台に固定するための面ファスナー
イソフルラン 99.9%	アボット・オーストラレーシア社	CASの26675-46-7	専有名:イソフロ(TM)吸入麻酔薬。VEP電極インプラント手術用の薬剤用吸入麻酔薬と酸素ガスの混合
ケタミン	トロイ研究所	イリウム・ケタミル	専売名:ケタミル注射、ブランド:イリウム。電気生理学的記録のための医薬品グレードの麻酔薬
ルクシオンLED	フィリップスライティング株式会社		光刺激には、20個の5ワットと1個の1ワットのLEDがあります。
マイクロマニピュレーター	ハーバード大学装置	BS4 50-2625	記録中にERGアクティブ電極を保持します
針電極	グラステレファクター	F-E2-30	テールに皮下挿入され、ERGとVEPの両方の接地電極として機能します
フェニレフリン2.5%ミニム	ボシュロム	CASの61-76-7	トロピカミドを注入して、ERG記録の最大の拡張を達成
ポビドンヨウ素 10%	サノフィ-アベンティス	CASの25655-41-8	専有名:ベタジン、手術用の剃毛肌を準備する消毒剤10%、500mL
Powerlabデータ収集システム	ADInstruments	ML 785	LED を制御します
プロキシメタカイン 0.5%	アルコン研究所	CASの5875-06-9	ERG記録中の角膜麻酔用
生理 食塩 水	ゲルフレックス		非注入可能、電気めっき用銀線電極用
スコープソフトウェア	ADInstruments	バージョン 3.7.6	Powerlabシステムを介して刺激をトリガーし、データを収集すると同時に
シルバー(細い丸線)	A&Eメタル	0.3ミリメートル	活性型および不活性型ERG電極、および不活性VEP電極の製造に使用されます
ステンレス製ストリールネジ	マイクロファスナー		シャフト径 0.7 mm、長さ 3 mm を一次視覚野に移植し、アクティブ VEP 電極として機能します
脳定位固定装置用フレーム	デビッド・コップフ	モデル900	PaxinosとWatsonの2007年のラット脳アトラス座標による一次視覚野の位置を特定するための小動物定位固定装置
外科用ブレード	スワン・モートン株式会社	206	VEP電極を埋め込むために一次視覚野を覆う皮膚の領域を切開するため
縫合	上海浦東金環医療製品有限公司		3-0シルク編組縫合糸非吸収性、VEP電極移植手術中の皮膚収縮用
トブラマイシン眼軟膏0.3%	アルコン研究所	CASの32986-56-4	独自の名前:Tobrex。手術後に皮膚創傷の周りに適用される予防的抗生物質軟膏
トロピカミド0.5%	アルコン研究所	CASの1508-75-4	専有名:0.5%ミドリアシル点眼薬、ERG記録のための散瞳を達成するために点滴
キシラジン	トロイ研究所	イリウムキシラジル-100	電気生理学的記録のための医薬品グレードの麻酔薬
ピペットチップ	エッペンドルフPty株式会社	0030 073.169	Eppendorf epTIPS 100 - 5000 mL、カスタムメイド電極用
レサバルブ安楽死注射	Virbac(オーストラリア)Pty Ltd	LETHA450	325 mg / mLペントバルビタールナトリウム(迅速な安楽死用
マイクロソフトオフィスエクセル	マイクロソフト	バージョン 2010	データ分析用スプレッドシートソフトウェア