1. パフピペット装置のセットアップ
>注:このセットアップには、ガラスピペット、チューブ、シリンジ、マイクロマニピュレータ、およびバッファ(ハンクス)の表1の5つの基本的なコンポーネントがあります。生理学的に関連する塩濃度を持つ任意のバッファーをこのセットアップで使用できます。
- マイクロピペットプーラーを使用して、ホウケイ酸ピペットを直径約45μmの開口部の先端に引っ張り、表2.
注:実験条件下では、45μmがピペット開口部の直径に適したサイズであることがわかりました。開口部のサイズがわずかに異なる場合でも、結果に大きな影響を与えることはありません。この数値からの大きな逸脱は、チューブを介してピペットにリンクされているシリンジの高さを調整することにより、静脈瘤誘発に引き続き機能するはずであることに注意することが重要ですが、これには圧力値の再校正が必要になります。
- ピペットの引っ張られていない端を細いゴムチューブに挿入します.
手記：チューブの壁は、液体の抵抗を最小限に抑えるために薄くて剛性が高く、シリンジの高さがピペットを流れる流体の圧力に正比例し、抵抗が無視できるようにします。チューブの長さは約0.6 m以下にして、抵抗をさらに最小限に抑える必要があります。
- チューブのもう一方の端を、回転式バルブ付きのコネクタを介して10 mLプラスチックシリンジに接続します。
手記：プラスチック製シリンジは、ピペットから流れる想定圧力を正確に測定するために、一定の測定可能な高さに保持する必要があります。190 mmの高さは、最小限の圧力を提供するが、軸索の静脈瘤を確実に誘発するため、利用されました。圧力によってセルがカバースリップ表面から剥がれる場合は、他の高さ値も使用できます。実験全体で同じ設定を使用することをお勧めします。
- ピペットをマイクロマニピュレーターのスクリュー上部に挿入して、ピペットを所定の位置に保持します。マイクロマニピュレーターアームに取り付けられた金属製のフラットトップネジをねじ込み、ゴムチューブが取り付けられている場所のすぐ上にピペットの引っ張られていない端を保持するようにします。ニューロンを含むカバースリップの表面に対して45°の角度でピペットを傾けます。注:マイクロマニピュレーターは、ゴムチューブを収縮させることなくピペットを保持できるように構成する必要があります。マイクロマニピュレーターは、ピペットをx、y、z方向に動かして、ピペットを細胞の範囲内に正確に配置する必要があります。装置のグラフィックと写真を以下に示します(図1)。
- 蛍光フィルターをオンにし、開口部を開けて、対物レンズから蛍光スポットが入ってくるのが見えることを確認します。マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットを先端と蛍光スポットが揃う位置に移動し、ピペットを細胞培養皿の高さ(35 mm x 10 mm)のすぐ上の位置に下げます。所定の位置になったら、透過光を点灯し、蛍光をオフにします。
- ピンセットを使用して、細胞培養プレートからカバースリップを1枚(細胞を上に向けて)を、室温で約2 mLのハンクスバッファーが入った細胞培養皿に加えます。
- カバースリップが入った培養皿をスコープに置きます。
- ファインフォーカスノブと20X対物レンズを使用して、セルの約4回転上(約0.4 mm)の平面に焦点を合わせます。マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットチップが焦点を合わせ、接眼レンズを通して見えるように平面の中央左側になるようにピペットチップを配置します。
手記：樹状突起は、その起源である細胞体と同じフレーム内にあるべき突起です。軸索静脈瘤を誘発するには、細胞体から内側および遠位の軸索へのより長い突起をたどる必要があります。
2. 伸縮性メンブレンシステムを利用したピペットの圧力の較正
- 上記と全く同じパラメータでパフピペット装置を、微細加工されたシリコーンメンブレン(直径500μm、厚さ50μm)を含むシステム上にセットアップし、顕微鏡をメンブレンの表面に焦点を合わせます
手記：このシステムは、小さな圧力値を測定するために設計されており、システムの説明は以前に公開されています。この測定は、まったく同じパフ設定を使用する場合、パフ実験で一度だけ行う必要があります。
- マイクロドットのアレイ(中心間で測定すると直径4 μm、間隔10 μm)に顕微鏡の焦点を合わせます。ストップバルブを回し、液体がピペットから流れ出るのを待ちます。共焦点顕微鏡で流体圧力に応じたメンブレンのたわみを調べます。
- 線形モデルを使用して、膜のたわみに関連する対応する圧力を決定します。
手記：最近の研究では、190 mm シリンジの高さで w= -3.143 ± 0.69 μm のたわみが得られましたが、これにより、現在のピペットのセットアップから 0.25 ± 0.06 nN/μm2 の圧力が生成され、これは生理学的および病理学的範囲内ですが、シリンジの高さは唯一の決定要因ではありません。また、ピペットの開口部、細胞に対するピペットチップの位置(距離と角度)、さらにはチューブの柔軟性など、ニューロンの正確な圧力値にも影響します。
3. 静脈瘤を誘発するためのパフ
- ピペットが所定の位置に配置されたら、対象領域を含む平面に顕微鏡の焦点を合わせます。細胞とプロセスをイメージングフィールドの左半分(カメラのライブキャプチャで見る)にパフ領域内に配置し、右半分をパフ領域の外側に配置します。
手記：ニューロンの軸索と樹状突起の広範な成長により、ニューロンのすべてのプロセスが同じ膨らみ領域内にある可能性は低いです。これは実際には、パフの局所的な影響を調べることができるこのシステムの利点の1つです。静脈瘤を誘発するために利用できるパフには、長時間のパフとパルスパフの2種類があります。
- パフ
- 長時間のパフ
- シリンジを、培養ニューロンを含むカバーガラスから190 mmの高さに配置します。最適化された露光時間で関心領域のタイムラプスイメージングを開始し、明確なニューロン形態を明らかにします。ベースラインとして 2 秒間隔 (合計 30 秒) で少なくとも 15 フレームをキャプチャします。間隔は実験に基づいて調整できます。フレーム16で、シリンジの回転可能なストップバルブを開き、液体を75フレーム(150秒)流れさせます。フレーム75で、バルブをオフにして、流体の流れが止まるようにします。ビデオキャプチャを停止します.
注:これにより、ニューロン7-9 DIVで軸索静脈瘤が5〜10秒以内に誘発されるはずですが、古いニューロンは静脈瘤を形成するのに時間がかかります。
- パルス(2秒持続時間)パフ
- シリンジを適切な高さ(190 mm)に配置します。タイムラプスイメージングを開始し、2秒間隔で少なくとも15フレーム(30秒)をキャプチャします。フレーム16で、シリンジのバルブを開いて液体を流し、2秒後にバルブを閉じます。バルブを再度開く前に、5〜20秒(テストする周波数によって異なります)待ちます。バルブの開閉を繰り返して流体パルスを作成し、合計150〜300秒間継続します。タイムラプスイメージングを20分間続けて、回復段階をキャプチャします.
手記：間隔が10秒より長い場合、パルスは静脈瘤を大幅に減らします。20秒間隔では、パルスによって静脈瘤を誘発することはできません。信頼性が高く、一貫した静脈瘤形成を得るためには、シリンジの高さを約190mmにすることをお勧めします。シリンジの高さと液圧は、細胞がカバーガラス表面から剥がれ始めるところまで上げないでください。
- 使用する前に、セットアップ(ピペット、チューブ、シリンジ)を約10 mLの70%エタノールに流して、セットアップ(ピペット、チューブ、シリンジ)を清掃してください。エタノール洗浄後、10 mLのハンク緩衝液(または所望の緩衝液)をセットアップに流し、その日の使用のためにシステムをプライミングします。その日の実験が終了したら、前述したようにエタノールでセットアップを清掃し、一晩で汚染物質が成長するのを防ぎます。
>表 1: ハンクのバッファー レシピ。このレシピでは、パフプロトコールおよび生細胞イメージング中に使用されるバッファーを調製します。
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の
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| ハンク緩衝液(フィルター、pH = 7.4、4°Cで保存 |
| 150 mM | NaCl |
| 4メートル | KClの |
| 1.2メートル | MgCl2 |
| 1 mM | CaCl2 |
| 10 mg / mL | D-グルコース |
| 20 mM | ヘープス |
>表2:ピペットの引き込みパラメータ。直径約45μmの開口部を得るためにピペットプーラーに設定するパラメータを提供します。
名
名
名
名
| ピペット引っ張りパラメータ |
| 熱 | 引っ張る | 速度 | 遅延 | 圧力 | ランプ |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
