マウス脳における安定した単一ニューロン記録のための注射可能なメッシュエレクトロニクス

要約

出典:Schuhmann Jr., T. G., et al. Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、メッシュエレクトロニクスプローブをマウスの脳に注入し、単一ニューロンレベルでの安定した長期記録を示しています。頭蓋骨が露出した麻酔マウスを脳定位固定装置フレームに固定し、プローブのメッシュデバイス領域をドリル穴から脳に注入します。プローブの入出力パッドは回路に接続されており、データ・アクイジション・システムを使用して記録が取得されます。

プロトコル

1. メッシュエレクトロニクスの生体脳への脳定位固定装置による

注入

>注:マウスは、75 mg / kgケタミンと1 mg / kgのデキストマイトールの混合物を使用した腹腔内注射によって麻酔されました。麻酔の程度は、手術開始前につま先つま先つまみ法で確認しました。麻酔下でマウスを37°Cの恒温性ブランケットに置くことにより、体温を維持しました。手術には、使用の1時間前にすべての金属製の手術器具をオートクレーブすること、滅菌手袋の使用、手術中の高温ビーズ滅菌器の使用、手術部位周辺の滅菌フィールドの維持、70%エタノールによるプラスチック器具の消毒、および脱毛した頭皮の皮膚を切開前にヨードフォアで調製することを含むがこれらに限定されない、適切な滅菌技術が実施されました。サバイバル手術は、手術終了後、創傷周囲に抗生物質軟膏を塗布し、マウスを37°Cの温熱パッドを装着したケージに戻しました。マウスは、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、放置されませんでした。マウスには、手術後最大72時間、12時間ごとに0.05 mg / kg体重の用量で腹腔内注射によるブプレノルフィン鎮痛剤が投与されました。.マウスは手術後に他の動物から分離されました。マウスは、270 mg / kg体重の用量でペントバルビタールの腹腔内注射または心血管灌流を介して安楽死させられました。.

1. マウスに麻酔をかけ、定位固定装置フレームに固定します。
2. 麻酔下での乾燥を防ぐために、マウスの目に眼用潤滑剤を塗布します。
3. デンタルドリルと脳定位固定装置フレームを使用して、頭蓋骨の希望の座標で開頭術を開きます。注入部位から離れた場所で2回目の開頭術を開き、ステンレス製の接地ネジまたはワイヤーを挿入します。
4. クランプ基材をデンタルセメントで頭蓋骨に固定します。基板に約 1 mm 幅の隙間を切って、手順の後半の折り畳みステップの信頼性を向上させます。
   手記：「L」字型にカットされたフラットフレキシブルケーブル(FFC)はうまく機能しますが(図4A)、32チャネルのゼロ挿入力(ZIF)コネクタ(厚さ0.18mm±0.05mmのケーブル用に設計)に適した厚さである限り、多くの材料が機能します。
5. メッシュ電子機器が入った針付きのピペットホルダーを、直角エンドクランプを使用して脳定位固定装置フレームに取り付けます(図2Cおよび図3A)。
6. ピペットホルダーのサイドアウトレットを、シリンジポンプ(図3D)に固定された5mLシリンジに取り付けます。これは、長さ約0.5〜1 mのキャピラリーチューブを使用します
   手記：キャピラリーチューブをピペットホルダーに接続する前に、キャピラリーチューブに気泡がないことを確認してください。気泡は注入中に流れを中断し、メッシュエレクトロニクスのスムーズで制御された供給を妨げる可能性があります。
7. 脳定位固定装置フレームを使用して、針の先端を脳内の目的の開始位置に配置します。
   手記：ここで使用するメッシュエレクトロニクスプローブは、記録電極を約2 mmの長さに広げ、メッシュエレクトロニクスの開始エッジ(図1Aの左端)から約0.5 mmの位置に最初の電極を配置するように設計されています。このため、定位固定装置の座標は、開始位置が関心のある脳領域より0.5 mm深くなるように選択する必要があります。メッシュエレクトロニクス内の記録電極の広がりと位置は、マスク設計プロセス中に自由に選択でき、記録電極が定位固定装置の軌道に沿って注入されるときに、記録電極が関心のある脳領域にまたがるように選択する必要があります。
8. カメラ(図3B)を、ガラス針内のメッシュ電子機器プローブの上部を表示するように配置します。一部のソフトウェアでは、ユーザーが画面上に線を引いてメッシュ電子機器の元の位置をマークできます。
9. シリンジポンプを低速に設定し、Startを押して流れを開始します。内径400μmのキャピラリーニードルの典型的な開始流量は10mL/hです。メッシュエレクトロニクスプローブが針内を動かない場合は、流量をゆっくりと増やします.
   手記：脳に注入される液体の量を最小限に抑えることは、注入部位の周囲の組織に損傷を与える可能性があるため、重要です。最良の結果は、注入メッシュ長 1 mm あたり 25 μL 未満の注入量で達成されます。理想的な値は、このボリュームの半分未満です。私たちの研究室では、通常、注入されたメッシュの長さ4mmあたり10〜50μLを注入します。
10. メッシュエレクトロニクスプローブが針内で動き始めたら、メッシュエレクトロニクスプローブが注入されるのと同じ速度で定位固定装置フレームを使用して針を引っ込めます。メッシュエレクトロニクスのマークされた元の位置をガイドとして使用します。
    手記：この手法は、視野角(FoV)注入法と呼ばれ、メッシュエレクトロニクスを標的の脳領域に正確に送達することができます。これは、しわくちゃや脱臼を伴わずに行うことができます。多くの場合、メッシュエレクトロニクスプローブが針内を移動し始めると、流量を減らすことができます。当研究室では、メッシュと毛細管針壁の間の静摩擦を克服するために20〜30 mL/hの流速が必要になることがよくありますが、注入プロセスが開始されると、その流速を10 mL/hに減らすことができます。流量と注入量は、通常、直径の小さい毛細血管針ほど小さくなります。
11. 生理食塩水を流し続け、針が頭蓋骨から出るまで針を引っ込めます。シリンジポンプからの流れを止めます。

2. 入出力インターフェース

>注:この時点で、メッシュエレクトロニクスプローブは、選択した軌道に沿って脳内の目的の開始点から注入されています。針は引っ込められ、開頭術のすぐ上にあり、メッシュの電子機器の相互接続が脳から針まで伸びており、入出力(I/O)パッドはまだ針の内側にあります(図4B)。このセクションでは、プリント回路基板(PCB;図4、図5)をメッシュエレクトロニクスプローブにインターフェースします。このPCBは、ZIFコネクタを32チャンネルの標準アンプコネクタに接続し、絶縁基板を介して神経記録実験のヘッドステージとなります。PCBは、さまざまなヘッドステージ構成に対応するようにカスタマイズ可能です。当社の設計ファイルは、リクエストに応じて、またはリソースWebサイト、meshelectronics.org から入手でき、PCB製造およびアセンブリサービスのベンダーからPCBを安価に購入するために使用できます。

1. 定位固定装置フレームを使用して、針をFFCクランプ基板に慎重に誘導し、ギャップを横切って、シリンジポンプで溶液を流して、メッシュ電子機器の相互接続にたるみを発生させます(図4C)。
2. ニードルがクランプ基板より上、ギャップを横切ったら、流れを高速で再開し、メッシュ電子機器のI/Oパッドをクランプ基板に排出します(図4D)。
3. ピンセットと脱イオン水(DI)のピペットを使用して、I / Oパッドを最初のI / Oパッドにできるだけ近い約90°の角度に曲げます。
   手記：曲げは、後続のステップでパッドをPCBのZIFコネクタに挿入できるようにするために必要です。ZIFコネクタは、メッシュエレクトロニクスプローブの32個のI/Oパッドとまったく同じ幅であるため、不完全な90°の曲がり、または最初のI/Oパッドの直前に曲がっていないと、I/Oパッド(図4Eの左端のパッド)を切断する必要があります。
4. I/Oパッドをメッシュステムに対して90°の角度で位置合わせし、広げたら、穏やかに流れる圧縮空気で所定の位置に乾かします。
   手記：32チャンネル未満のメッシュエレクトロニクスプローブは、同じ32チャンネルインターフェースボードとインターフェースできます。たとえば、私たちのラボでは、通常、16チャンネルのメッシュエレクトロニクスプローブと32チャンネルのPCBを使用しています。これにより、ZIFコネクタ内に余分なスペースが確保され、インターフェースが容易になり、追加の未接触チャネルは、録音セッション中のインピーダンステストによって開回路として簡単に識別できます。
5. クランプ基板をI/Oパッドの端から約0.5〜1mmの直線エッジで切断します。また、PCBに取り付けられた32チャネルZIFコネクタへの挿入を妨げるクランプ基板の無関係な部分を切り取ります(図4F)。
6. I/OパッドをPCBのZIFコネクタに挿入し、ラッチを閉じます(図4G)。測定用電子機器を使用して、チャンネルとアースネジ間のインピーダンスを測定し、インターフェースが成功したことを確認します。インピーダンス値が高すぎる場合は、ZIFコネクタのラッチを外し、挿入を調整し、接続が成功したことを確認するまで再テストします。
7. ZIFコネクタと露出したメッシュ電子機器の相互接続を歯科用セメントで覆って保護します。基板の隙間でPCBを裏返し、PCBをセメントでマウスの頭蓋骨に固定します(図4H).
   手記：ギャップでFFCを曲げると、メッシュ電子機器の相互接続を破損する可能性のある機械的な負担が軽減されます。
8. セメントを硬化させ、PCBを堅牢でコンパクトなヘッドステージに変え、その後の記録セッションでインターフェースします(図4I)。

3. 神経記録実験

1. マウスをテールベイナーまたは別の拘束具に入れます。プリを挿入します amplifier PCBを標準に挿入します amplifierヘッドステージPCBのコネクタ。別のケーブルを使用して、基準ネジを接地します。
2. 録音を拘束する場合は、マウスを拘束したままにします。データ収集システムを使用して、目的の期間データを記録します(図5A)。
3. 自由に動き回る録音の場合は、プリを挿入した後、マウスを拘束装置から離します amplifier PCBと基準ネジを接地します。マウスが自由に動作している間に、データ収集システムを使用して必要な時間だけ記録します(図5B)

結果

図1:プラグアンドプレイメッシュエレクトロニクスの写真と光学顕微鏡画像。(A)プラグアンドプレイI / Oを備えたシリンジ注入可能なメッシュエレクトロニクスプローブのタイル付き光学顕微鏡画像。プローブは、図2の製造ステップの完了後、Niコーティング基板からの放出前に画像化されました。破線のボックスは、左から右に、C、D、Eで拡大された超柔軟なデバイス領域、ステム、およびI/O領域のセクションに対応しています。スケールバー = 1 mm. (B) 20個の完成したメッシュ電子プローブを含む3インチSiウェーハの写真。スケールバー=20mm.(C)直径20μmのPt超フレキシブルデバイス領域の記録電極の光学顕微鏡画像。スケールバー = 100 μm. (

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
電動定位固定装置用フレーム	世界の精密機器	MTM-3	マウス脳定位固定装置手術用
512チャンネル録音コントローラー	インタンテクノロジーズ	C3004	神経記録システムの構成要素
RHD2132アンプボード	インタンテクノロジーズ	C3314	神経記録システムの構成要素
RHD2000 3フィートの超薄型SPIインターフェースケーブル	インタンテクノロジーズ	C3213	神経記録システムの構成要素
マウス拘束具	ブレインツリー・サイエンティフィック	TV-150 STDの	標準の内径 1.25 インチ。制限された録音セッション中にマウスを拘束するために使用されます。
ガラスキャピラリーニードル	ドラモンドサイエンティフィック株式会社		内径0.40mm、外径0.65mm。他の直径も利用可能です。
マイクロピペットホルダー Uタイプ	モレキュラーデバイス合同会社	1-HL-U	脳定位固定装置の注入中にガラス毛細血管針を保持するために使用されます
1 mLシリンジ	NORM-JECT®, ヘンケ・サス・ウル		メッシュ電子機器をキャピラリーニードルに手動で装填するために使用されます
ポリエチレンイントラデスミックカテーテルチューブ	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー		内径1.19mm、外径1.70mm
5 mLシリンジ	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー		in vivoでのメッシュエレクトロニクスの注入用シリンジポンプに使用
接眼レンズカメラ	Thorlabs株式会社	DCC1240C	注射中に毛細血管針内のメッシュエレクトロニクスを表示するために使用されます
USBカメラ用ThorCam uc480画像取得ソフトウェア	Thorlabs株式会社		注射中に毛細血管針内のメッシュエレクトロニクスを表示するために使用されます
シリンジポンプ	ハーバード大学装置	PHD 2000	メッシュエレクトロニクスの注入中に、キャピラリーニードルに正確な量の溶液を流すために使用されます
EXL-M40歯科用ドリル	長田	〒3144-830	開頭術の穴あけ用
0.9 mmドリルバリ	ファインサイエンスツール	19007-09	開頭術の穴あけ用
ホットビーズ滅菌器 14 cm	ファインサイエンスツール	18000-50	手術器具の滅菌に使用
CM1950クライオセクショニング機器	ライカマイクロシステムズ		凍結した組織を切片にスライスするために使用されます。多くの大学が持っています
直角エンドクランプ	Thorlabs株式会社	RA180/M	ピペットホルダーを脳定位固定装置フレームに取り付けるために使用します
プリント回路基板(PCB)	アドバンストサーキット		メッシュ電子機器とIntan記録システムなどの周辺測定電子機器との間のインターフェースに使用されます。Advanced Circuitsおよびその他のベンダーは、製造および 提供された設計ファイルに基づいてPCBを組み立てます。当社のPCB設計ファイルは、ご要望に応じて、またはリソースサイトで入手できます meshelectronics.org
32チャンネル標準アンプコネクタ	オムネティクスコネクタ株式会社	A79024-001 (日本語)	PCBに組み立てられたコンポーネント
32チャンネルフラットフレキシブルケーブル(FFC)	モレックスLLC	152660339	メッシュ電子機器のI/OパッドとPCBマウントのZIFコネクタとインターフェースする際のクランプ基板として使用
32チャネルゼロ挿入力(ZIF)コネクタ	ヒロセ電機(株)	FH12A-32S-0.5SH(55)	PCBに組み立てられたコンポーネント

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