方法論記事

脳スライスにおける電気生理学的記録のための全細胞電圧クランプ構成の確立

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2025年7月8日

この記事について

要約

出典:Sunstrum, J. K., et al.全細胞パッチクランプ電気生理学を用いたシナプス多重度の評価。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、細い先の尖ったピペットを脳スライスの近くに配置して、ニューロン細胞とシールを形成する方法を示します。吸引により細胞膜が破壊されるため、電気生理学実験の電流測定を可能にする全細胞パッチクランプが形成されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ソリューション

  1. スライシングソリューション
    1. スライス液の組成については、表1を参照してください。
    2. あらかじめ20倍ストック溶液を調製し、4°Cで最大1ヶ月間保存してください。
    3. 1xスライス溶液については、NaHCO3、グルコース、およびスクロースをddH2Oに溶解し、20xストックを加えます。浸透圧が315〜320 mOsmであることを確認し、溶液を4°Cで1週間以内に保管します。
    4. 2つのビーカーに100mLのスライス液を入れ、パラフィルムで覆います。溶液を冷凍庫で部分的に凍結するまで冷やします(-80°Cの冷凍庫で約20分)。ガス分散チューブを使用して、スライス溶液の両方のビーカーを95%O2 / 5%CO2で氷上で20分間泡立てます。
  2. aCSF(人工脳脊髄液)、スライスの回復と維持
    1. aCSFの組成については、表1を参照してください。
    2. あらかじめ20倍ストック溶液を調製し、4°Cで最大1ヶ月間保存してください。
    3. 1x aCSFの場合、NaHCO3とグルコースをddH2Oに溶解し、20xストックを添加します。浸透圧が298〜300 mOsmであることを確認してください。1日以内に解決策を使用してください。
  3. aCSF(録音用の低Ca2+)
    1. 低Ca2+ aCSFの組成については、表1を参照してください。
    2. あらかじめ20倍ストック溶液を調製し、4°Cで最大1ヶ月間保存してください。
    3. 1倍低Ca2+ aCSFの場合、NaHCO3とグルコースをddH2Oに溶解し、20倍(CaCl2およびMgCl2フリー)ストック、CaCl2およびMgCl2を指定濃度まで添加します。浸透圧が298〜300であることを確認してください。1日以内に解決策を使用してください。
  4. aCSF(録音用Sr2+)
    1. Sr2+ aCSFの組成については、表1を参照してください。
    2. あらかじめ20倍ストック溶液を調製し、4°Cで最大1ヶ月間保存してください。
    3. 1x Sr2+ aCSFの場合、NaHCO3とグルコースをddH2Oに溶解し、20x(CaCl2およびMgCl2フリー)ストック、SrCl2およびMgCl2を指定濃度まで添加します。浸透圧が298〜300であることを確認してください。1日以内に解決策を使用してください。
  5. 内部ソリューション
    1. K-グルコン酸ベースの内部溶液の組成については、表1を参照してください。
    2. 20 mLの内部溶液を作るには、50 mLのチューブに15 mLの分子生物学グレードの水を加えます。次に、氷上で後続の手順を実行します。
    3. 分子生物学グレードの水に1 Mストック濃度になるように、事前に以下の溶液を調製してください。(mL)追加:2.32 K-グルコン酸、0.24 Na-グルコン酸、0.20 HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)、0.16 KCl、0.05 K 2-EGTA(エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N、N、N'、N'-四酢酸)、0.04 MgCl2を50 mLチューブに加えます。
    4. 0.3 M Na3GTP (グアノシン 5′-三リン酸ナトリウム塩) 100 μL を添加
    5. 2 mLの微量遠心チューブに44.08 mgのK2 ATP(アデノシン5′-三リン酸二カリウム塩)を秤量し、1 mLの分子生物学グレードの水を加えてから、50 mLのチューブに加えます。
    6. pHを7.2〜7.4に調整し、1 M KOHを使用します。浸透圧が283〜289 mOsmであることを確認してください。

2. スライスの準備

  1. ツールの準備
    1. 回収チャンバー(4つのウェルとネットを備えた250 mLビーカーで構成)に200 mLのaCSFを加え、回収チャンバーをウォーターバス(35°C)に入れます。
    2. チャンバーをパラフィンフィルムで覆い、ガラス分散チューブを使用してaCSFを95%O2/5%CO2で少なくとも20分間絶えず泡立てます。
    3. 解剖ツール(メス、角度付き細かいハサミ、鉗子、細かい絵筆、プラスチックスプーン)をセットアップします。
    4. 60 mLシリンジに、ステップ1.1.4の約15 mLの氷冷スライス溶液を入れます。
    5. ウェルプレートの蓋に濾紙を置いて、解剖プラットフォームを準備します。
    6. スライシングチャンバーを製氷皿に入れ、皿に氷を入れて準備します。
    7. 使い捨てブレードをブレードホルダーに固定して、ビブラトームをセットアップします。
    8. トランスファーピペットを作るには、パスツールピペットの先端を折って、壊れた端にゴム球を置きます。
  2. マウスの脳を解剖する
    1. 脊髄反射がなくなるまで、4%イソフルランで飽和したチャンバーで動物に麻酔をかけます。
    2. ギロチンを使用して動物の首を切り、すぐに脳を取り除きます。
      1. 22号メスの刃で吻側から尾側まで正中線を切開します。
      2. 横方向に、頭の両側の頭皮をむきます。
      3. 細かいハサミを使用して、脳を傷つけないように注意しながら、頭蓋骨の片側を尾側から吻側(前頭骨の側面を含む)に切ります。
      4. 鉗子を使用して頭蓋骨片を脳から持ち上げ、ステップ2.1.4の注射器を使用して15mLの氷冷スライス溶液で脳をすばやく冷却します。
      5. 頭蓋骨から脳を持ち上げます。
      6. 95%O2 / 5%CO2で泡立った氷冷スライス溶液(ステップ1.1.4から)で満たされたビーカーの1つに脳を置きます。

3. マウスの視床下部のスライスを準備します。

  1. 脳を目的の脳領域にブロックし、角度をカットします(例:冠状視床下部スライスの場合、ブレードを使用して組織の吻側を視交吻部に、尾側を橋にトリミングし、尾側ブロックが脳の基部に垂直な平らな面を持つようにします)。
  2. カットしたろ紙を使用して、脳を前面からピックアップし、瞬間接着剤を使用して保持プレートに後面を接着します。
  3. 保持プレートをスライスチャンバーにすばやく置き、手順1.1.4で2番目のビーカーからのスライス溶液で満たします。
  4. スライシングチャンバーと製氷トレイをビブラトームに固定します。
  5. スライス領域(脳の前後)を定義し、厚さ250μmの冠状スライスのスライスを開始します。推奨パラメータ:速度0.10 mm / s、振幅2 mm。
  6. スライスを目的の脳領域に適したサイズにトリミングします。
  7. スライスを35°Cで30〜45分間回収します。次に、リカバリーチャンバーを加温槽から取り出し、スライスを室温でさらに30分間回復させます。スライスを一日中室温に保ち、95%O2 / 5%CO2で常にバスを泡立て続けます。

3. 全細胞パッチクランプ録音

  1. パッチピペットを引きます。​
    1. ピペットプーラーのマニュアルから全細胞記録に推奨されるパラメータを使用して、厚肉ガラスからパッチピペットを3〜5MΩのピペット抵抗まで引き出します。
    2. マイクロシリンジ(市販または自家製)を使用して、ピペットチップにろ過された内部溶液を充填します。マイクロシリンジを作るには、1mLのシリンジの先端を燃やして先端を落下させると、細長い先端ができます。
  2. 全セル構成を取得します。
    1. 記録ピペットをスライスのすぐ上に置き、電圧クランプモードでピペット電流をオフセットします。ピペットにわずかな陽圧を加え、ストップコックをロックします。
    2. 無傷のメンブレンを持つ健康な細胞を選択し、ピペットでそれに近づきます。陽圧は、組織にわずかな乱れを引き起こすはずです(つまり、侵入時に組織にゆっくりと波がかかります)。
    3. ピペットが細胞表面に小さなくぼみを形成するまで、斜めの動きを使用してピペットを細胞にゆっくりと近づけ続けます。
    4. 陽圧ロックを解除します。セルはシールを形成し始め、抵抗は1GΩを超えて増加します。電圧クランプで、セルを-68mVに保持します。
    5. セルから余分な圧力を取り除くために、セルから斜めに少し引き離します。
    6. 高速ピペット容量と低速ピペット容量を補正します。
    7. ピペットホルダーに接続されたチューブを通して短時間の吸引を加えて、セルを突破し、全細胞構成を取得します。
    8. 電気生理学データ取得および分析ソフトウェア(Clampexなど)のメンブレンテストウィンドウでセルモードに切り替えます。
    9. 各電圧クランプの記録の前に、同じソフトウェアを使用してメンブレンテストを実行し、関連するパラメータ(メンブレン抵抗、アクセス抵抗、および静電容量)をラボブックに記録します。
    10. その後の実験のために、記録槽の温度を27〜30°Cに、流速を1.5〜2.0mL/minに保ちます。

>表1:さまざまなソリューションの構成。

の 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名
溶液濃度(mM)
スライス正常な aCSF低Ca2+aCSFSr+ aCSFピペット/インターナル
NaCl87126126126-
KClの2.52.52.52.58
CaCl20.52.50.5--
SrCl2---2.5-
MgCl271.52.51.52
NaH2PO41.251.251.251.25-
NaHCO325262626-
グルコース25101010-
蔗糖75----
K-グルコン酸----116
Na-グルコン酸----12
ヘープス----10
K2-エグタ----1
K2ATPの----4
ナ3GTP----0.3

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開示事項

利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1mlシリンジBDの309659
10ブレードフィッシャーサイエンティフィック/その他35698
22ブレードVWR/その他21909-626
22 uM シリンジフィルターミリポア09-719-000
アドソンフォレセプスハーバード・インストゥルメンツ〒72-8547
角度のついた鋭いはさみハーバード・インストゥルメンツ〒72-8437
クランペックス分子デバイスpクランプ10
ダブルエッジブレードVWRの〒74-0002
濾紙シグマ/その他1001090
細い絵筆フィッシャー/各種15-183-35/各種
ガス分散チューブVWRのLG-8680-120
イソフルランフレゼニウス・カビ/ほかM60303
クレイジーグルー諸諸
ミニ分析シナプトソフトミニアナリシス 6
オスモモーターウェスコー株式会社モデル5600
パラフィルムシグマPM-996
パスツールピペットVWRの14672-200
pHメーターメトラー・トレドFE20-ATCの
ゴム球VWRの82024-550
メスの柄No.3ハーバード・インストゥルメンツ〒72-8350
メスの柄No.4ハーバード・インストゥルメンツ〒72-8356
シングルエッジブレードVWRの55411-050
ビブラートスライサーライカVT1200S
浄水システムミリポアミリQアカデミックA10
ウェルプレートの蓋フィッシャー/各種07-201-590/各種
CaCl2 2H2OシグマC7902
CdCl2シグマ202908
エグタシグマE3889
グルコースシグマG5767
ヘープスシグマH3375-J
K2-ATPのシグマA8937の
KClのシグマP9333型
K-グルコン酸シグマG4500
MgCl2 6H2OシグマM2670
分子生物学グレードの水シグマW4502-1Lシリーズ
Na3GTPのシグマG8877
NaClバイオショップSOD001.1
Na-グルコン酸シグマS2054
NaH2PO4シグマ71504
NaHCO3シグマS6014
ピクロトキシンシグマP1675
SrClシグマ255521
蔗糖バイオショップSUC507.1
の シリーズ の

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