動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. pHuC_Mermaidプラスミドの生成
>注:マーメイドは、ホスファターゼ(Ci-VSP)を含むCiona intestinalis(現在のCiona robusta)電圧センサーの電圧センシングドメイン(VSD)と、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)パートナーの蛍光色素であるUmi-Kinoko Green(mUKG:ドナー)およびオレンジを放出する蛍光タンパク質Kusabira Orange(mKOk:アクセプター)の単量体バージョンを組み合わせて開発されたバイオセンサーです。このバイオセンサーでは、膜の脱分極によって誘発されるVSDドメインのコンフォメーション変化により、ドナー蛍光タンパク質とアクセプター蛍光タンパク質の近接性が増大し、両者間のエネルギー移動が増加します(FRET比が増加します)。VSDは、細胞膜でのバイオセンサーの効率的な局在を保証します。バイオセンサーのニューロン発現(脊髄では、介在ニューロンと運動ニューロンの両方で信号が検出可能)は、ゼブラフィッシュの汎神経プロモーターHuCの下でマーメイドオープンリーディングフレーム(ORF)をクローニングすることによって達成されます。
- T3 UniversalプライマーとMermaid SmaIプライマー(5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTTTA)を使用して、Pfu(プルーフリーディング)DNAポリメラーゼを含むpCS4+マーメイドプラスミドのマーメイドオープンリーディングフレーム(ORF)をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅し、マーメイドORFの上流にSmaI制限部位を挿入します。
各- プライマーの総容量50 μLに、0.5 μLのPfu DNAポリメラーゼ、7.5 μLの特異的10倍バッファー、1 μLの10 mMデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)、2.5 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)、0.5 μL(50 ng)のプラスミド調製物、および各プライマーの20 μMストック溶液1 μLを、以下のPCR混合物を使用してください。
- PCR混合物を95°Cで15秒間加熱し、50°Cで15秒間プライミングし、72°Cで4分間合計35サイクル伸長します。
- 市販のゲル精製キットを使用して、製造元のプロトコルに従って、特異的な鈍重なPCR産物をゲル精製します。
- DNA断片をpCMV-SC平滑ベクターにクローニングします。
- マーメイド陽性プラスミド(pCMV-SC_Mermaidと命名)をSmaI制限酵素で直鎖化し、その後のHuCプロモーターの挿入に使用します。
- 制限反応を次のように設定します:0.5 μL(10 U)のSmaI制限酵素、2 μLのキット10xバッファー、および5 μgのプラスミドDNAを総容量20 μLで、反応を25°Cで1時間インキュベートします。
- 市販のゲル精製キットを使用して、メーカーのプロトコルに従って消化されたプラスミドをゲル精製します。
- 一対のHuC特異的プライマー(HuCprom-forw1_SalI: 5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA and HuCprom-rev1: 5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG)を使用し、ATGの上流3,150 bp領域にまたがって、Pfu DNAポリメラーゼとゼブラフィッシュゲノムDNAをテンプレートとして、HuCプロモーター(pHuC)をPCR増幅します。
- 0.5 μL の Pfu DNA ポリメラーゼ、7.5 μL の特異的 10x バッファー、10 mM dNTP 1 μL 1 μL、2.5 μL の DMSO、200 ng のゲノム DNA、および各プライマーの 20 μM ストック溶液 1 μL を総容量 50 μL のスキームで PCR 混合物をセットします。
- 最初のステップを95°Cで2分間行った後、PCR混合物を95°Cで15秒間加熱し、50°Cで15秒間プライミングし、72°Cで4分間合計35サイクル伸長します。
- 市販のゲル精製キットを使用して、製造元のプロトコルに従って特異的な鈍的PCR産物をゲル精製します。
- 精製したpCMV-SC_Mermaid(ステップ1.5)とpHuC DNA(ステップ1.7)を、1 μLのT4 DNAリガーゼと1 μLの特異的10Xバッファーを使用して、等モル量でライゲーションします。反応を4°Cで16時間インキュベー
トします。
- コンピテントセルのアリコートを5 μLのライゲーション反応で形質転換します(ステップ1.8)メーカーの指示に従ってください。
- プロモーターを適切な向きで挿入した pHuC陽性クローン (pHuC_Mermaid) を Sal I-EcoRV ダブル消化で選択します (SalI 制限部位はステップ 1.6 でプロモーターフラグメントの上流に挿入されていますが、EcoRV 制限部位は pCMV-SC プラスミドのポリアデニル化領域 PolyA の下流に位置しています)。
- 制限反応を次のように設定します:SalIおよびEcoRV制限酵素0.5 μL(10 U)、kit10Xバッファー2 μL、およびpHuC_Mermaid DNA1 μgを総容量20 μLで行い、反応を37°Cで1時間インキュベートします。反応をアガロースゲルにかけます。
2. 胚マイクロインジェクション
- 野生型(AB系統)またはSod1-G93R成魚のゼブラフィッシュ成魚から得られた受精卵を、プラスチックピペットを用いて10mmシャーレに移します。
- 胚を冷水(4°C)の魚水ですすぎ、直ちにマイクロインジェクターを使用して200 pgのpHuC_Mermaidプラスミドを卵黄にマイクロインジェクションします(マイクロインジェクション手順の全体的かつ詳細な説明を参照)。
- プラスチック製ピペットを使用して、胚をペトリ皿に移し、次の分析のために目的の発達段階(受精後20〜24時間、hpf)に達するまで28°Cの魚水中でインキュベー
トします。
3. 自発的なテールコイリング解析
>注:リルゾール薬の有無にかかわらず、20-24 hpf胚の自発的な尾巻き挙動を評価してください。
- 0.2%DMSO(リルゾールビヒクル)を含む魚水で満たされた90mmの丸いペトリ皿に胚を移し、先端が鋭い2つの宝石鉗子を使用して手動でデコリオネーションします。胚を5分間インキュベートします。
- 実体顕微鏡に取り付けたデジタルカメラを使用して、1分間のビデオ録画中に室温(RT)でのテールコイリングを検出します。30フレーム/秒の時間分解能で時系列を取得します。
- 時間単位あたりの曲がり数(対側と同側の両方)を数えることにより、自発的なテールコイリングの頻度を計算します。
- リルゾール薬の効果を評価するには、プラスチック製のパスツールピペットを穏やかに使用して、5μMのリルゾールを含む魚水で満たされた新しい90mmのシャーレに胚を移します。.
- 胚を5分間インキュベートしてから、1分間のビデオを録画し、上記のように行動分析を行います。
4. 生きた胚のマーメイドバイオセンサー可視化のためのイメージングセットアップ:ドナーシグナルとアクセプターシグナルの同時検出
- 20 - 24 hpfの胚を1%低融点アガロースに1%低融点アガロースに37°Cの魚水中に35 mmのガラス底イメージングディッシュ内にマウントします。胚を横向きにします。アガロースが室温で固まるまで待ちます。
- イメージングディッシュを倒立顕微鏡に取り付けられた倒立共焦点のステージに移します。488 nmのアルゴンレーザーラインでmUKGを励起し、495 nmから525 nmの間でその発光を記録することにより、20倍対物レンズ(0.7開口数、NA)でバイオセンサーを発現する運動ニューロンを特定します。
- FRET測定には、FRETペアのドナーであるmUKGを488nmレーザーラインで励起します。8,000Hzの双方向モードで動作するレゾナントスキャナーで、ドナーが発する蛍光(495〜525nm)とmKOkアクセプターが発する蛍光(550〜650nm、FRETチャネル)を同時に検出します。可能な場合は、473nmレーザーを使用してください。
手記：ドナーの励起効率はわずかに低下しますが(488 nmの93%ではなく85%)、アクセプターの交差励起も減少します(488 nmの17%から473 nmのレーザーラインで9%に)。
- 光毒性と蛍光色素の漂白を減らすには、レーザーライン(取得ソフトウェアのビームパスウィンドウ上)の出力を減らして、サンプルの照明を最小限に抑えます。
- 実験の開始時に設定され、セッション全体で一定に保たれるゲインとオフセットのパラメーターに一致するように、励起を最適化します。オフセットを設定するには、(Q ルックアップ テーブルを使用して) 画像の色を強度値に変更し、レーザーをオフにしてスキャンするときにオフセット ノブ (スマート オフセット) を回して、背景ピクセルの強度が 0 よりわずかに高くなるようにします。同じルックアップテーブルを使用して、スキャン中にレーザーをオンにすることにより、ゲインノブ(スマートゲイン)を回して、ピクセルが飽和しないように注意しながら、信号対雑音比を最大化します。
- 開いたピンホール(2エアリーユニット)を使用して、16ビット画像を取得し、定量分析に十分なダイナミックレンジを提供します。取得速度を上げ、光退色を最小限に抑えるために、平均化は避けてください。
- ソフトウェア取得ウィンドウで、ドロップダウンメニューから512 x 64ピクセル(ピクセルサイズ:605 nm)の画像フィールドサイズを選択します。
- 取得モードウィンドウから、ドロップダウンメニューからxyt(単一のXY平面上のタイムラプス)を選択し、単一のXY平面を取得して胚脊髄ニューロン電圧の変化を記録し、取得パラメータを30ミリ秒ごとに1つの画像を1分間記録するように設定します。
- 同じニューロンの膜脱分極に対するリルゾール投与の効果を評価するには、5 μM のリルゾールを含む魚水の添加から 5 分後に新しいデータセットを取得します。
- FRET解析には、ImageJマクロBiosensor_FRET(一鎖FRETバイオセンサーを発現)を使用します。
- t1 における各ニューロンの基底膜 FRET 比を ((FRET 平均 - FRETバックグラウンド)/(ドナー平均 - ドナー バックグラウンド)) として評価します。ここで、FRETおよびドナー平均強度は、取得した各チャネルの細胞の周囲に描かれた同じ関心領域(ROI)で計算された平均蛍光強度であり、FRETおよびドナーバックグラウンドは、蛍光サンプルを含まない視野のROIで計算された平均蛍光強度です。
手記：プラグインの使用に関する詳細なステップバイステップの説明は、www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret Web サイトにあります。
- グラフ作成ソフトウェアを使用して、異なる実験パラダイム間での脱分極の周波数、振幅、および時間を比較します。対応のないスチューデントのt検定を使用して2つのグループを比較し、Pが0.05の場合、平均値を統計的に異なると考え<。
