In vivoでのマウス前肢筋の複合筋活動電位の測定

要約

出典:Pollari, E. et al., 運動ニューロン変性マウスモデルにおける前肢からの複合筋活動電位のIn Vivo電気生理学的測定。J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、マウスの複合筋活動電位(CMAP)を測定するためのin vivo技術を示しています。電極のセットアップ、筋線維を神経支配する前肢ニューロンの刺激、および筋肉の反応の記録の手順を概説しています。この手法は、ニューロンの脱髄と機能的ニューロンの喪失を評価します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 動物の調合と麻酔

1. イソフルラン/酸素吸入でマウスに麻酔を誘発します。麻酔の導入には4%のイソフルランを使用し、2.5 L / minの酸素の流れでの維持には2〜3%を使用します。マウスの状態に応じて、麻酔の維持のためのイソフルランの割合を調整します、すなわち、小さくて弱いマウスはより少ない麻酔薬を必要とします。後肢のウォーキングパッドに軽度の圧力を加えて、痛みの離脱反射がないことを確認するなどして、適切な麻酔を確認します。
2. 麻酔中の体温低下を防ぐために、37°Cのサーモスタット加熱プレートを使用してマウスの体温を制御します。
3. マウスにノーズコーンを装着し、麻酔の維持に役立てます。ノーズコーンが気道を塞がないこと、および動物が安定して呼吸していることを確認することにより、動物が十分な酸素を供給できることを確認します。
4. 記録中、マウスが十分に麻酔されているかどうかをモニターし、呼吸数(麻酔で約1Hz)と軽度の圧力での離脱反射の欠如を観察します。麻酔が十分に深くない場合は、手動でイソフルラン濃度を上げます。
5. 測定後、マウスを加熱プレート上または赤外線ランプの暖かさで回復させ、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、約2〜5分間放置します。マウスが麻酔から完全に回復するまで、マウスを放置して他のマウスと一緒に放置しないでください。

2. ForelimbsのCMAPの測定

1. 前肢のCMAP測定には、27G針電極を使用します。電極の推奨位置決め場所については、図1を参照してください。
2. 次のように前肢に電極を配置します。
   1. マウスを加熱パッドの仰臥位に置き、粘着テープを使用して体の側面にある両前肢を伸ばします(図1B)。
   2. 刺激電極(1 =アノードと2 =カソード)を前肢の両側に皮下に配置して、腕神経叢神経と整列させます。皮膚を持ち上げて針を皮膚に垂直に挿入し、下にある筋肉に穴を開けずに針を約5mm皮膚の下に押し込みます。
   3. 皮膚を持ち上げて、記録電極(3)を上腕二頭筋の上に皮下に置きます。参照電極(4)を30度の角度で深さ3mmのウォーキングパッドに置きます。接地電極(5)をマウスの側面に皮下に置きます
      手記：このセットアップでは、電極は互いに近接しています。電極が互いに接触すると記録が歪むため、電極が接触しないようにしてください。

>3. データ取得

1. コントローラーユニットのリリカレント刺激ボタンを押して刺激を開始し、強度コントローラーノブを回して刺激を増やします。1パルス/秒、0.1msの刺激持続時間ですべての軸索を刺激します。ソフトウェアのドロップダウンメニューから正しい周波数と期間を選択します。
2. 超最大刺激(5-20 mA、最大60 mAの脱髄条件)に到達するには、CMAP応答の振幅の増加が止まるまで強度コントローラーノブを回して、増加刺激を適用します。そこから、刺激をさらに20%増加させて、CMAP振幅が最大応答に達したことを確認します。再発刺激ボタンをもう一度押して刺激を終了します。
3. マーカーツールを使用して、記録内の次のポイントを示します:刺激の開始、応答の開始、最大正のピーク、および最大負のピーク(図2)。
4. 遅延(ミリ秒単位)を、刺激の開始から応答の開始までの遅延として求めます(図2)。応答の開始を、振幅が増加し始める最も早い点として定義します。潜伏時間を使用して、軸索の脱髄を評価します。
5. 最大の負のピークから最大の正のピークまでの振幅(mV)を測定します(図2)。振幅の大きさを使用して、機能的な軸索の数を相関させます。

結果

図 1.CMAP測定用の電極の位置決め。電極の位置は、後肢(A)と前肢(B)に示されています。電極には、1:アノードと2:陰極刺激電極、3:アクティブ記録電極、4:参照電極、5:接地電極という番号

が付けられています。

図 2.CMAPレスポンスの代表画像。振幅とレイテンシの計算に使用されるポイントを示す記述的なCMAP応答(A)。潜伏時間は、刺激からCMAP応答の開始までの遅延によって決まります。ピ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
再利用可能な皮下針電極、Pl/Ir	テクノメッド	TE/S61-434	ニードルの長さは13 mm(0.51インチ)、直径は0.4 mm(27G)です
Natus電気診断システム	ナタス神経学	ウルトラプロ S100	EMGデバイス
シナジー	ナタス神経学	バージョン 20.1.0.100	UltraPro S100用筋電図ソフト
フィジアイテムコントローラー	ロサッチャーメディカルGmbH	TCAT-2LV	ヒーティングパッド
combi-vet ベース麻酔システム デジタル流量計 TEC 3 気化	Rothacher & Partner(ロサチャー&パートナー)	履歴書30-301-D	イソフルラン気化器と流量計
Iso-Vet 1000 mg/g	ピラマルヘルスケアUKリミテッド	AP/ドラッグ/220/96	イソフルラン
SOD1-G93Aマウス	ジャクソン研究所	#002726	ALS tgおよび非tg制御同腹仔、女性のみ
PrP-hFUS-WT3マウス	ジャクソン研究所	#017916	ALS tgと非tgは同腹仔を制御し、すべてのグループはオスとメスでバランスが取れています
C57BL/6Jaxマウス	ジャクソン研究所	#000664	軸索切開術用の非tgマウス、オスおよびメス
C61-PMP22マウス	マウス系統は、M. Sereda教授(The Max Planck Institute of Experimental Medicine, Göttingen, Germany)から寛大に寄贈されました。		CMT tgおよび非tgは同腹仔を制御し、すべてのグループはオスとメスでバランスが取れています