光刺激に対するショウジョウバエ網膜光受容体の電圧応答の電気生理学的記録

要約

出典: Juusola, M., et al. Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptor and Interneurons to Light Stimuli In Vivo. J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオでは、動けなくなったショウジョウバエの眼の光受容体活動の電気生理学的記録のプロトコルを概説し、光刺激に応答した電圧変化の正確な測定を可能にします。

プロトコル

1. R1-R6 感光体からの記録

1. 微小電極アンプを操作するときは(例:ampファラデーケージの金属面または防振テーブルに触れるなど)、これにより、誤ってヘッドステージに静電荷が供給され、回路が損傷する可能性があるため、常に接地してください。
2. フライ準備プラットフォームのポールを上から2つのグースネックライトガイド(図1A)(ファラデーケージ内の冷光源を使用)で照らし、フライホルダーをポールの好ましい位置に配置できるようにします。
3. フライホルダー(フライが入ったもの)をフライ準備プラットフォームのポールに取り付けます。フライホルダーを回転させて、フライの左目が直接研究者に向くようにします(図1B)。
4. 鈍い参照電極をハエのオセリを通してヘッドカプセルに静かに挿入し、実体顕微鏡で調製物を観察しながら、小さな粗いマイクロマニピュレータを使用します(図1C)。電極を深く押しすぎると、ハエの脳が損傷する可能性があるため、押し込まないでください。
   1. または、参照電極を胸部の背面に挿入します。ハエが健康に見える(アンテナを動かす)こと、および目が無傷で、誤って損傷していないことを常に確認してください。準備が完璧でないように見える場合は、実験用に新しいフライを準備します。
5. ワセリンで覆われた小さな開口部から、鋭利な記録微小電極を左目に打ち込みます。実体顕微鏡で高倍率を使用し、光ガイドと焦点面を動かして、電極先端の位置がその反射パターンによって3Dで明らかになるようにします.
   注:図1Dは、光受容体記録のためにハエの頭をどのように配置すべきか(記録微小電極が目に入る角度に対して)を示しています。電極を壊さずに目に打ち込むことは、実験の最も難しい段階です。電極の先端が目の小さな開口部を見逃して角膜に当たると、通常は電極が壊れます。
6. 両方の電極が準備物の内側にしっかりと入り、ハエの体液と電気的に接触したら、微小電極増幅器をオンにします。
7. 冷光源(ファラデーケージ内)の電源を切り、主電源からプラグを抜きます。プラグを中央のアースに接続して、グランドループによる電気ノイズを最小限に抑え、グースネックライトガイドを遠ざけて、カルダンアームシステムをフライの周りで自由に動かせるようにします。部屋の照明を消して、フライの準備が比較的暗いことを確認します。
8. 目の中の記録電極の抵抗を測定します。抵抗が100〜250MΩ.
   の記録電極のみを使用してください 手記：<70MΩの電極で高品質な細胞内記録を実現することは事実上不可能です。抵抗が<80MΩの場合は、電極先端が壊れている可能性があります。この場合、アンプのスイッチを切り、記録電極を交換してください。
9. アンプを電流クランプ(CC)またはブリッジ録音モードに設定します。記録電極と参照電極の間の任意の電圧差は、電気的に相互接続された細胞外空間にあるため、信号オフセット(記録電圧)をゼロに設定することで相殺します。アンプのディスプレイ読み出しまたはオシロスコープ画面を使用して、信号オフセットの変化を追跡します。
10. フライアイが暗順応するまで2〜3分待ちます。
11. 記録電極の先端を0.1〜1ミクロンの小さなステップで目の奥深くまで打ち込みます。これを行うには、リモートコントロールマイクロマニピュレーターのx軸ピエゾステッパーを使用するか、手動マニピュレーターの微調整ノブを静かに回転させます。
12. 記録電極が組織内で前進しているときに、短時間(1〜10ミリ秒)の光の点滅でフライアイを刺激します。
    手記：記録電極が網膜に配置され、眼が正常に機能している場合、各光の閃光は、網膜電図(ERG)と呼ばれる電圧の短時間で小さな低下(0.2〜5 mVの過分極)を引き起こします。この細胞外空間の電界電位の変化は、光に対する網膜細胞の集団的応答によって引き起こされます。

結果

図 1.実験用のフライホルダーと電極の位置決め。(A-B)フライホルダーは記録プラットフォームに配置され、ペルチェ素子(A:中央の白い丸いプラットフォーム)を介して温度制御も行います。カルダンアームは、光源(液体または石英の光ファイバー束の端)を直接目に向けて、フライの周りの等距離(x、y回転)に光刺激を正確に配置することができます。当社の多くのリグでは、光刺激はLED(リニア電流ドライバー付き)またはモノクロメーターによって生成されます。したがって、それらの刺激は、300〜740 nmの間で選択され、4〜6 log強度単位範囲(別々の減光フィルターによって減衰される)をカバーする特定の(バンドパスされた)スペクトル含有量を運びます。(C)別々のマイクロマニピュレーターによって制御される2つの微小電極がフライヘッドに配置されています:参照電極(上)はオセリを通して;左目の小さな開口部を通る記録電...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フライの準備をするためのステレオズーム顕微鏡	オリンポス	SZX12 DFPLFL1.6倍PF接眼レンズ:WHN30x-H/22	~150倍の倍率で長い作動距離を実現、特注の重厚スチール製テーブルマウントスタンド
細胞内セットアップの実体顕微鏡	· オリンパス	オリンパスSZX7、接眼レンズ:WHN30x-H/22	電極を小さな角膜の穴から目に打ち込むときに電極先端の反射をよく見るには、30倍の接眼レンズが必要です
ニコン顕微鏡	ニコンSMZ645;接眼レンズ:C-W30x / 7
防振テーブル	メレス・グリオ	ブレッドボードにメートル法のM6穴付き	私たちのオーダーメイドのリグには、厚いブレッドボードに開けられた大きな穴があり、フライ準備プラットフォームのポール(電子機器付きの銅製ヒートシンクを収納)を下から差し込むことができます
ニューポート
マイクロマニピュレーター	成茂	成重 NMN-21	当社の細胞内セットアップでは、SHAP記録電極をフライアイに駆動するために、さまざまなマイクロマニピュレーターシステムが使用されます。リストされているすべてのマニピュレータは、ショウジョウバエの光受容体およびLMCからの長期にわたる安定した記録を成功裏に提供しています。
ハクスリー・バートラム	ハクスリーXYZ軸、細かい手動制御
センサペックス	Sensapex 3軸
メルツホイザー	Märzhäuser DC-3K、x軸ピエゾステッパー、MS 314コントローラーを追加
マグネティックスタンド	オン/オフスイッチ付きの磁気ベースなら何でもかまいません		たとえば、ファラデーケージ内のケーブルを管理するには
電極ホルダー	ハーバード大学装置	ESP/W-F10N
シルバーワイヤー	世界の精密機器	AGW1510	直径0.3 - 0.5 mm、電極ホルダーは塩素化する必要があります
光ファイバー光源	オリンパスを含む多くの異なる
光ファイバーバンドル	UltraFineテクノロジー		LED光刺激をCardanアームシステムに送達します。液体と石英の両方のライトガイド(UVからIRまでの範囲)を使用します
ソーンラボ
フライキャシングチューブ		P80-50P 50ml セントチューブ PP. 100個入り	50 mlのプラスチック遠心チューブから円錐形の底を切り取り、1 mlのピペットチップを接着します。
デジタルアクイジションシステム	ナショナルインスツル
単極電流/電圧クランプ微小電極増幅器	NPIのSEC-10LX	http://www.npielectronic.de/ 製品/アンプ/SEC-シングル electrode-clamp/sec-10lx.html	抜群のパフォーマー!
ヘッドステージ	スタンダード (+/- 150 nA)	NPI用 SEC-10LX
LED光源とドライバー	2チャネルOptoLED(Cairn Research Ltd.、英国)		当社の刺激システムの多くは社内で構築されています
自己設計および構築
アクイジション&アナリシスソフトウェア	多くの企業から選択可能		Biosyst; Juusola研究室での実験的および理論的研究のためのカスタムメイドのMatlabベースのシステム
パソコンまたはMac			PCまたはMacがデータ集録システムおよびソフトウェアと互換性があることを確認してください
カルダンアームシステム	自己設計および構築		光刺激の正確なx、y、z位置を提供
ペルチェ素子温度制御システム	自己設計および構築
ファラデーケージ	自己構築		電磁ノイズシールド
フィラメント化ホウケイ酸ガラスキャピラリー		外径:1 mm
内径:0.5 - 0.7 mm
フィラメント石英ガラスキャピラリー		外径:1 mm
内径:0.5 - 0.7 mm
ピペットプーラー	サッターインストゥルメントカンパニー	モデルP-2000レーザーフレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー	ホウケイ酸参照電極の場合は、プリセットプログラム#11(パッチ電極)を使用します:熱= 350; フィラメント= 4;速度36;遅延 = 200).1.2.1)です。ホウケイ酸記録電極の場合は、プリセットプログラム#12を使用します(これは通常、光受容体記録に適した従来の鋭利物を引き出します):熱= 355;フィラメント= 4;速度50;遅延 = 225;プル = 150。LMC記録では、先端の細い電極が必要なため、これらの値を調整する必要があります。石英キャピラリーを引っ張るために、P-2000のマニュアルは のプログラムを提案しています 先端が細い微小電極。これらのプログラムのプリセットパラメータは、便利な出発点として機能します 良好な浸透成功と低記録ノイズの電極を生成するための体系的な変更。
参照電極用の細胞外リンガー溶液	フィッシャーサイエンティフィックの化学品	10326390、NaCl 10010310、KCl 10147753、TES 10161800、CaCl2 10159872、MgCl2 10000430, 蔗糖	プロトコルセクションのレシピを参照してください
フィラメント記録微小電極を充填するための3 M KCl溶液	フィッシャーサイエンティフィックの塩	10010310、KCl
ワセリン	ワセリン