動けなくなったゼブラフィッシュ幼生における求心性ニューロンからの電気信号のモニタリング

要約

出典:Lunsford, E. T., et al.ゼブラフィッシュの遊泳中の後側線求心性ニューロンの活動。J. Vis. Exp. (2021年)。

このビデオは、麻痺したゼブラフィッシュの幼生の求心性ニューロンからの電気信号の記録を、側線神経節の近くにマイクロピペットを配置し、信号捕捉のための緩いシールを形成する方法を示しています。細胞外溶液は、この過程でニューロンの生存率を維持します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 電気生理学的記録のための材料の準備

1. シリコンエラストマー底のレコーディングディッシュを作ります。
   1. 自己混合シリコーンエラストマー成分(Sylgardなど)の薄層を、浅いウェルの縁と同じ高さになるまで、カバーガラス底組織培養皿に分注します。約0.5mLで十分です。
   2. 皿に蓋をして、室温で最低48時間硬化させます。
2. 解剖ピンを作ります。
   1. DC電源を使用して、エッチング液(3M KOH)の100 mLビーカーに負電荷(5 V)を供給し、タングステンワイヤー(0.002インチ、直径50.8 μm)を正に帯電した出力に接続します。
      注意： この手順では、マイナス線とプラス線が互いに接触しないようにしてください。これは、火花を発生させるリスクがあり、火災の危険をもたらす可能性があるためです。
   2. タングステンワイヤーをエッチング液浴に素早く繰り返し浸し、先端が鋭利になるまでエッチングします。実体顕微鏡で、ストレートエッジのカミソリの刃でワイヤーを先端から約1mm切断します。さらに3回繰り返してから、細い鉗子を使用して硬化した記録皿にピンを挿入します。
3. 記録電極を準備します。
   1. ボックスフィラメント付きの水平マイクロピペットプーラーを使用して、ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ(内径:0.86 mm、外径:1.50 mm)を、直径30 μmの先端にわずかに先細りの電極(図1 Ai)に引き込み、後側方線から求心性ニューロンを記録するために使用されます。
   2. 追加のホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを、先端径が小さい(1〜5μm)一対の電極に引き込みます。両手に1つの電極を持ち、先端を互いにそっと通して~30°の角度に壊します。マイクロフォージを使用して、斜めの先端を滑らかになるまで磨きます。
4. 電気生理学記録プログラムでプロトコルを生成します。
   1. 右ヘッドステージが、求心性ニューロン記録用の微小電極電流および電圧クランプアンプの背面にあるチャネル1入力に接続されていることを確認します。
      メモ: 電流および電圧クランプアンプのコンピュータ仕様には、1 Ghz 以上のプロセッサ、Windows XP Pro または Mac OS X 10.46.6、512 MB の RAM を搭載した CD-ROM ドライブ、500 MB のハードドライブ容量、および 2 つの USB ポートが最低限必要です。
   2. コンピュータ制御のアンプソフトウェアを開きます。
   3. チャンネル1を電流クランプモードに設定するには、ICボタンをクリックします。
   4. [I-Clamp 1]タブで次のパラメータを入力します。プライマリ出力:100x AC膜電位(100,000 mV / mV)、ゲイン:1,000、ベッセル:1 kHz、AC:300 Hz、スコープ:バイパス。二次出力:100x AC膜電位(100 mV / mV)、ゲイン:1、ローパスフィルター:10 Hz。
   5. チャネルパラメータをCh1_Affとして保存します。
   6. パッチクランプ電気生理学ソフトウェアをインストールして開きます。
   「
   7. Configure」をクリックし、「Lab Bench」を選択し、BNC同軸ケーブルでアンプの対応するチャンネル1スケール出力に接続されたデジタイザチャンネル(アナログ入力#0やアナログ入力#1など)にCh1_Affを追加してアナログ信号を設定します。OK.
      をクリックします。 メモ: デジタイザのコンピュータの最小要件は、1 Ghz 以上のプロセッサ、Windows XP Pro または Mac OS X 10.46.6、CD-ROM ドライブ 512 MB RAM、500 MB のハード ドライブ容量、および 2 つの USB ポートです。
   8. 「Acquire」をクリックし、「New Protocol」を選択します。
   9. 「Mode/Rate」タブで「Gap Free」を選択し、「Acquisition Mode」で「Trial Length」を「Use available disk space」または「Record until Stopped」または希望する「Duration (hh:mm:ss)」に設定し、「Sampling Rate per signal (Hz)」を20,000に設定して分解能を最大化します。
   10. [入力]タブで、以前に構成したアナログINチャンネル(手順1.4.6)を選択し、対応するチャンネルのCh1_Affを選択します。
   11. 「Outputs」タブで、「Channel #0」と「Channel #1」にそれぞれ「Cmd 0」と「Cmd 1」を選択します。
       1. アンプのチャンネル1コマンドをBNC同軸ケーブルを介してデジタイザーのアナログ出力0に接続します。
   12. 残りのタブはデフォルト設定のままでかまいません。[OK]をクリックして、プロトコルを保存します。

>2. 溶液の調製

1. ハンク溶液を調製します:137 mM NaCl、5.4 mM KCl、0.25 mM Na₂HPO₄、0.44 mM KH₂PO₄、1.3 mM CaCl₂、1.0 mM MgSO₄、4.2 mM NaHCO₄、pH 7.3。ストックに適切な量の脱イオン水を加えて、ハンク溶液を10%に希釈します。
2. 細胞外溶液を調製します:134 mM NaCl、2.9 mM KCl、1.2 mM MgCl₂、2.1 mM CaCl₂、10 mM グルコース、および10 mM HEPESバッファー、pH 7.8をNaOHで調整。孔径0.22μmのフィルターで細胞外溶液を真空ろ過します。
3. α-ブンガロトキシンを調製する:凍結乾燥α-ブンガロトキシン1mgを10mLの細胞外溶液に溶解して、0.1%希釈します。.
4. 安楽死溶液を調製する:50%(mg / L)緩衝医薬品グレードのMS-222を10%ハンク溶液に
   注意:α-ブンガロトキシンは、コリン作動性受容体を遮断することにより筋肉を麻痺させる強力な神経毒です。手袋が必要であり、麻痺患者を取り扱う際には目の保護具をお勧めします。

>3. 電気生理学的記録のための幼虫の準備

1. ゼブラフィッシュの幼生を動けなくします。
   1. ゼブラフィッシュ(Danio rerio、受精後4〜7日)の実験室で飼育された集団の幼虫を使用し、27°Cの胚溶液(10%ハンク溶液)に保管します。
   2. 先端の大きいトランスファーピペットを使用して、幼虫をハウジングから小さなペトリ皿(35 mm)に移し、周囲の溶液をできるだけ多く取り除きます
      手記： 胚液を除去すると、麻痺薬の希釈を防ぎ、その効果を高めます。タスクワイプの角は、残りの胚溶液を吸い上げるために使用でき、幼虫に接触したり、空気にさらしたままにしたりしないことが重要です。
   3. 幼虫を10 μLの0.1% α-ブンガロトキシンに約5分間浸します
      手記： 幼虫を固定するのに必要な時間は、準備によって異なります。健康的な準備は、持続的な速い血流と運動反応の低下を注意深く監視することにかかっています。麻痺薬に短時間過剰にさらされると、徹底的なウォッシュアウトの後でも、製剤の全体的な健康状態がゆっくりと低下する可能性があります。幼虫が完全に動けなくなる前に、微妙な筋肉振動の兆候が見られるうちに洗濯をするのが最善です。
   4. 麻痺した幼虫を細胞外溶液で洗い、10分間入浴します
      手記： ウォッシュアウトにより、幼虫は微妙な筋肉の振動から完全な麻痺に移行することができます。また、α-ブンガロトキシンは、ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)α9サブユニットのアンタゴニストであり、これはこのプロトコルが観察する内因性フィードバック回路の重要な構成要素です。しかし、この効果は、10分間のウォッシュアウト後にXenopusおよびゼブラフィッシュの有毛細胞で可逆的であることが示されています。
2. 録音皿に魚をピン留めします.
   手記： ゼブラフィッシュ幼生(4-7 dpf)の調製時には麻酔(MS-222、トリカインなど)は必要ありません。これは動物の健康を妨げるためです。実際、ゼブラフィッシュの幼生は特定の脊椎動物のプロトコルから免除されています。
   1. トランスファーピペットを使用して、幼虫を細胞外溶液浴からシリコン底の記録皿に移します。皿の残りの部分を細胞外溶液で満たします。
   2. 実体顕微鏡下で、先端の細い鉗子で幼虫をシリコンマットの中央より上に、側面を上にして、体の前端と後端をそれぞれ左から右に走らせます。次に、先端の細い鉗子を使用してシリコンマットからエッチングされたピンをつかみ、シリコンと直交するように、幼虫の背側脊索を介してピンを肛門に直接挿入します。テールの端近くの脊索に2番目のピンを挿入し、ガス膀胱の背側に3番目のピンを挿入します(図1B).
      手記： ピンを挿入する際は、血流を妨げたり周囲の筋肉組織を傷つけたりしないように、脊索の幅の中心を狙うことが重要です。脊索は後側方神経の背側にあるため、適切にピン留めすれば、側方感覚ニューロンに損傷を与えることは期待できません。周囲の組織を乱さないように、最初の接触後に挿入します。理想的には、ピンの直径は脊索の幅の半分未満にして、きれいに挿入できるようにします。ピンがこの幅を超える場合は、目的のピン幅に達するまで手順1.2を繰り返します。ピン留め後に血流が遅くなる場合は、新しい検体でステップ1.3以降を繰り返します。
   3. ピンが封止材に挿入されるときに前方に向かってわずかに回転させながら、4番目のピンを耳小胞に挿入します(図1B)。わずかな回転が加えられると、cleithrumと耳小胞の間の組織を観察して、求心性体細胞のクラスターが現れます
      手記： 4番目のピンの角度付き挿入は、後側方線求心性神経節の露出を確保するためのものであり、これはそうでなければ大きな耳介によって妨げられます。

4. 求心性ニューロンの記録

1. 求心性記録電極に30μLの細胞外溶液を充填し、右ヘッドステージピペットホルダー(図1B、C)に挿入し、空気圧トランスデューサによって生成された正圧(1〜2mmHg)を印加しながらディッシュ溶液に下げます。
2. 後側線求心性神経節を見つけて緩く取り付けます。
   1. マイクロマニピュレータを使用して、求心性電極の先端をcleithrumの上に保持されるまで下げます。
   2. 倍率を40倍に増やし、後側線神経と後部脊椎の交点を特定します。後部脊髄から前方の側線神経をたどり、線維が後側方線求心性神経節を神経支配する場所まで続き、体細胞の離散的なクラスターによって区別できます(図1F)。
   3. 電極の先端を求心性神経節の上に持ってきて、先端が上皮に接触するまでピペットを下げます。.先端の全周が求心性神経節に接触するように、電極を静かに操作します。
   4. 空気圧トランスデューサーで負圧(20-50 mm Hg)を加え、保持します。
      手記： 求心性神経節に加えられる負圧は穏やかです。陰圧を上げるとS/N比は改善できますが、持続的な積極的な吸引により求心性ニューロンの健康状態が悪化し、記録が成功する確率が低下します。
3. 求心性ニューロンの活動を記録します。
   1. 左側のヘッドステージはアンプに接続する必要があります amplifierは、増幅された信号をデジタイザに中継し、デジタイザは、その信号をパッチクランプ電気生理学ソフトウェアに出力して、隣接するコンピューターで監視します。
   2. pClamp10 で、ツールバーの [再生] ボタンをクリックして、求心性ニューロンを監視します。
   3. 求心性ニューロンの細胞全体のルーズパッチ記録が、スパイクが自発的に発生すると、約100〜200ミリ秒ごとに達成されることを確認します(図1E)。
   4. 徐々に、求心性ニューロン記録電極の圧力を大気圧(0 mm Hg)に戻し、記録の残りの部分を保持します。

結果

図1:後側方索求心性ニューロンと腹側運動根活動の同時電気生理学的記録。(A).ルーズパッチ求心性神経(i)と腹側運動根(ii)の記録電極の例。(B)ゼブラフィッシュの幼生を麻痺させ、シルガード皿に4箇所(十字記号)でピン留めして、記録の安定性を確保します。太字の十字は、ピンの挿入ポイントを表します。(C)電気生理学リグは、防振テーブルに取り付けられ、40倍の倍率が可能な電動コントローラー上の直立固定ステージ顕微鏡で構成されています。デュアル電流クランプと電圧クランプヘッドステージは、マイクロマニピュレータに取り付けられています。(D)体の筋肉組織のミオメアは、運動ニューロンの樹状化の記録ランドマ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100mLビーカー	パイレックス	1000	エッチング液用レセプタクル
10倍水浸対物レンズ	オリンポス	UMPLFLN10xWの	幼虫の位置決めと記録電極のための低倍率
40倍水浸対物レンズ	オリンポス	LUMPLFLN40XW	位置電極先端の高倍率化とパッチクランプの確立
BNC同軸ケーブル	トールラボ	2249-C-12	アンプとデジタイザ・チャンネルの接続。4個必要
ホウケイ酸ガラスキャピラリーw /フィラメント	ワーナー・インストゥルメンツ	G150F-3	内径:0.86、外径:1.50、記録電極形成用キャピラリーガラス
コンピュータ	該当なし	該当なし	どのコンピューターでも動作するはずです
DC 電源	天満	72から420	解剖ピンの電気エッチングに使用
電気生理学デジタイザー	軸索機器、分子デバイス	アクソン DigiData 1440A	パッチクランプデータの取得が可能
フィラメント	サッターインストゥルメントカンパニー	FB255Bの	マイクロピペットプーラーに使用される2.5mmボックスフィラメント
細い鉗子	ファインサイエンスツール	デュモン #5 (0.05 x 0.02 mm) 商品番号 11295-10	幼虫の操作とピンの挿入に使用されます
固定ステージDIC顕微鏡	オリンポス	BX51WI	パッチクランプ記録の視覚化と確立に使用される顕微鏡
柔軟性のあるテーパーピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	02-707-169	柔軟なチップにより、記録電極に挿入して、先端で細胞外溶液を分注
フルオロディッシュ	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(株)	FD3510-100	カバーガラス底皿収録皿
キムワイプ	キムテック	34155	幼虫から余分な水分を吸い上げるために使用されるタスクワイプ
クイックガード	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(株)	710172	自己混合シルガードエラストマー
微小電極増幅器	軸索機器、分子デバイス	マルチクランプ 700B	デュアルチャンネル録音用のパッチクランプアンプ
マイクロフォージ	成茂	MF-830マイクロフォージ	記録電極を研磨する
マイクロマニピュレーター制御ユニット	シスキユー	MC1000-eR/T	マイクロマニピュレータ制御用4軸ダイヤルコーディネーター
マイクロピペットプーラー	サッターインストゥルメントカンパニー	フレーミング/ブラウン P-97	キャピラリーガラスを記録電極に引き込むため
顕微鏡制御ユニット	シスキユー	MC1000Eの	顕微鏡を固定ステージと準備の周りに配置
モーター式マイクロマニピュレーター	シスキユー	MX7600	ヘッドステージと付属の記録電極をパッチクランプ録音用に配置
マルチクランプコマンダー	分子デバイス	2.2.2	Axon MultiClamp 700B Commanderダウンロードページからダウンロードできます
光学式エアテーブル	ニューポートコーポレーション	VH3036W-オプト	ブレッドボードアイソレーションテーブルにより、顕微鏡を浮かせ、記録中の振動を最小限に抑えます
pクランプ	分子デバイス	10.7.0	Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software ダウンロードページからダウンロード可能
ペトリ皿	隼	35-3001	幼虫を麻痺薬に浸すために使用されます
ピペットホルダー	分子デバイス	1-HL-U	記録電極を保持し、ヘッドステージに接続します
空気圧トランスデューサ	フルーク・バイオメディカル・インスツルメンツ	DPM1Bの	記録電極内圧制御用
水酸化カリウム	シグマ・アルドリッチ	221473から25G	解剖ピンのエッチング用エッチング液
シリコーンチューブ	タイゴン	14-169-1A	空気圧トランスデューサーをピペットホルダーに接続するためのチューブ
実体顕微鏡	カールツァイス	ステミ2000-C	ピンチップの視覚化や幼虫の調製に使用されます
ストレートエッジカミソリ刃	カノープス	amazon.com からご注文	解剖ピンを作りながらタングステンワイヤーを切断
注射器	ベクトン・ディキンソン・コンポニー	309602	記録電極に注入するための細胞外溶液を充填
トランスファーピペット	シグマ・アルドリッチ	Z135003-500EA	幼虫を移すための使い捨て、非滅菌ピペット
トリカインメタンスルホン酸	シンデル	12854	高用量で幼虫を安楽死させるために使用される医薬品麻酔薬。
タングステンワイヤー	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(株)	715500	0.002インチ、50.8μm径、解剖ピンの製作に使用
真空濾過ユニット	シグマ・アルドリッチ	SCGVU11RE	電気生理学電極リンガーに使用される細胞外溶液の滅菌に使用される使い捨ての滅菌真空ろ過ユニット
電圧クランプ電流クランプヘッドステージ	分子デバイス	CV-7B型	左右のヘッドステージとして使用されるMultiClamp 700Bアンプが付属
α-ブンガロトキシン	サーモフィッシャー	B1601	記録前に幼虫を固定するため

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