冠状海馬切片における誘発カリウムイオン濃度ダイナミクスの測定

要約

出典:Octeau, J. C. et al.成体脳の組織切片におけるカリウムイオン選択的微小電極の作成、テスト、および使用。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオは、マウスの冠状海馬脳スライスの電気刺激に対する誘発されたカリウムイオン濃度ダイナミクスを示しています。海馬のCA3領域のラジタム層にバイポーラ刺激電極を挿入し、CA1ラジタム層にカリウムイオン選択電極を配置します。電気刺激により活動電位が発生し、カリウムイオンが放出されます。最後に、阻害分子の存在下で誘発されるカリウムイオン応答の欠如は、カリウムイオン濃度のダイナミクスがSchafferの担保における活動電位の生成によるものであることを確認しています。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 急性海馬脳切片の作製

1. スライス溶液の調製
   1. 194 mMスクロース、30 mM NaCl、4.5 mM KCl、10 mM D-グルコース、1 mM MgCl₂、1.2 mM NaH₂PO₄、および26 mM NaHCO₃、290-300 mOsm、95%O₂および5%CO₂で飽和した500 mLのショ糖切断溶液を調製します。
   2. 124 mM NaCl、4.5 mM KCl、1 mM MgCl₂、10 mM D-グルコース、2 mM CaCl₂、1.2 mM NaH₂PO₄、および26 mM NaHCO₃; pH 7.3 - 7.4 (バブリング後)、290 - 300 mOsm、95% O₂および5% CO₂で飽和した1〜2リットルの記録溶液(人工脳脊髄液、ACSF)を調製します。.ブレインスライスホルダーチャンバーを含むビーカーに記録溶液を入れ、32〜34°Cに保ちます。
2. 急性スライス調製
   1. マウスを2〜3mLのイソフルランを事前に充填したベルジャーに入れて、マウスに深く麻酔をかけます。つま先のつま先挟み反射をチェックし、反応しない場合は、動物のプロトコルで必要なように、鋭利な鋏またはギロチンを使用してすばやく首を切ってください。
   2. 頭蓋骨の尾側部分から鋏を使用して2〜3cmの切開を行い、正中線に沿って頭皮を切断します。頭皮を手動で引っ込めながら、大孔から頭蓋骨の側面に沿って1cmの水平切開を2回行います。次に、細かい鋏を使用して、頭蓋骨の後ろから鼻までの正中線に沿って、頭蓋骨の長さを切開します。
   3. 正中線近くに挿入された細い鉗子を使用して、切開した頭蓋骨を2つの部分に引っ込めます。頭蓋骨からマウスの脳を取り出し、ブレードを使用して、脳の尾側と吻側にそれぞれ位置する小脳球と嗅球を取り除きます。これらは、皮質から分離する大きな亀裂によって識別できます。
   4. ブレインブロックを瞬間接着剤を使用してビブラートトレイに取り付けます。ビブラトームトレイに氷冷切断液を入れます。
   5. 冠状面上の組織切片を厚さ300μmで切断します。通常、冠状海馬スライスを6枚集めることができます。
   6. 各セクションがカットされたら、すぐにスライスを32-34°Cに温めたスライス保持ビーカーに移します。 この温度で20分間セクションを保持してから、セクションを含むビーカーを取り外し、これを少なくとも20〜30分間室温に置いてから記録します。

2. 電気的に誘発されるK⁺ダイナミクスの測定

1. スライス調製のセットアップ
   1. パスツールピペットを使用して脳のスライスをバスにそっと置き、ナイロン弦付きのプラチナハープで静かに固定します。
   2. バイポーラ刺激電極の先端が互いに平行で、スライスの平面と同じ高さであることを確認してください。ゆっくりと、6〜7秒かけて、電極をCA3層半径に約40〜50μmの深さで挿入し、シェーファーの担保を刺激します。冠状切片では、CA3は、海馬の適切な部分として、海馬の顆粒細胞層の外側としておおよそ識別でき、橈骨層は錐体細胞層の内側と腹側に落ちています。
   3. K⁺選択電極をCA1層半径約50μmの深さに、電極を約3〜4秒かけてゆっくりと下げることにより、慎重に挿入します。スライスに刺激を加える前に、電極全体で電位が安定するのを待ちます:これには通常5〜10分かかります。スライスが細胞外K⁺に自発的な変化を示す場合は、このプロセスを破棄し、新しいスライスでこのプロセスを繰り返します。
2. 誘発されたK⁺放出の測定
   1. 刺激装置のトリガーを手動で押し下げて、一連の電気刺激(8パルス)を印加し、応答をデジタルで記録します。10 μAの刺激振幅から始めて、10 Hzおよび1 msのパルス幅で刺激を適用します。
   2. 最大K⁺応答振幅が検出されるまで、刺激振幅を2倍に増やして適用します。応答が見られない場合は、K⁺電極の位置を刺激部位に100μmずつ近づけます
   3. 半値最大応答を生成する刺激振幅を決定します。私たちの経験では、これは40〜160μAで、調製品質、動物の年齢、刺激電極とK⁺選択電極の間の距離によって異なります。
   4. 同じスライスで、半値最大応答を生成する振幅よりも1ステップ低い刺激振幅を使用します(たとえば、80μAが半値最大応答を生成する場合は、40μAを使用します)パルス数の増加する刺激列を適用します。当初は、1、2、4、8、16、32、64、128パルスの列を使用してきました。
   5. K⁺ 信号が電気刺激された Schaffer 担保浴の活動電位発火によって媒介されることを確認するには、ACSF に 0.5 μM テトロドトキシン (TTX) を 10 分間適用し、刺激プロトコルを繰り返します。誘発された反応は観察されるべきではありません。.
   6. スライス実験が終了したら、キャリブレーション溶液で電極を再キャリブレーションし、応答が初期キャリブレーションから10%以上逸脱していないことを確認することにより、電極がその応答性を維持し
   ていることを確認します

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ビブラトーム	DSKの	マイクロスライサーゼロ1
マウス:C57BL/6NTac近交系マウス	タコニック	在庫#B6
顕微鏡	オリンポス	BX51
pクランプ10.3	分子デバイス	該当なし
カスタムマイクロフィル28Gチップ	世界の精密機器	CMF28Gの
タングステンロッド	A-Mシステムズ	716000
バイポーラ刺激電極	FHCの	MX21XEW(T01)
刺激アイソレーター	世界の精密機器	A365
グラスS88刺激装置	グラスインスツルメンツカンパニー	S88
ホウケイ酸ガラスピペット	世界の精密機器	1B150-4
AからDボード	デジデータ 1322A	Axon インスツルメンツ
シグナルアンプ	マルチクランプ 700A または 700B	Axon インスツルメンツ
ヘッドステージ	CV-7B ネコ1	Axon インスツルメンツ
パッチ コンピュータ	谷間	該当なし
塩化ナトリウム	シグマ	S5886
塩化カリウム	シグマ	P3911
ヘープス	シグマ	H3375-J
炭酸水素ナトリウム	シグマ	S5761
リン酸ナトリウム一塩基性	シグマ	S0751
D-グルコース	シグマ	G7528
塩化カルシウム	シグマ	21108
塩化マグネシウム	シグマ	M8266
バリノマイシン	シグマ	V0627-10mg
1,2-ジメチル-3-ニトロベンゼン	シグマ	40870-25ミリリットル
テトラキスカリウム(4-クロロフェニル)ホウ酸塩	シグマ	60591-100ミリグラム
ヘプタン中の5%ジメチルジクロロシラン	シグマ	85126-5ミリリットル
TTXの	ケイマンケミカルカンパニー	14964
塩酸	シグマ	H1758-500mL
蔗糖	シグマ	S9378-5kg
ピペットマイクロマニピュレーター	サッター	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
対物レンズ	オリンポス	PlanAPO 10xW