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$$\longrightharp{xx}$$,
サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
>注:Q175野生型(WT)およびヘテロ接合体(HET)からの録音は、年齢や性別を問わず実行できます。ここでは、51週齢から76週齢の男性と女性を研究しました。
1. コルチコストリアタル軸索の発現のためのグルタミン酸センサーiGluuの注入
- ピペットプーラー(ワンステップモード)を使用して、ウイルスを注入するためのホウケイ酸ガラスピペットを準備します。引っ張った後、手動でピペットを壊して、先端径を30〜50μmにします。ピペットと頭蓋骨を開くためのドリルを含む手術器具をオートクレーブします。
- ウイルスAAV9-CaMKIIa.iGluuを保存します。WPRE-hGH (7.5 x 1013gc/mL) を -80 °C で 10 μL アリコート中。ウイルス産生直後(6か月以内)に注射を行う場合は、5°Cに保ちます。手術前にバイアルを取り出し、室温で維持してください。
- ガラスピペットに水を入れ、気泡を取り除きます。
- 87.5 mg / kgのケタミンと12.5 mg / kgのキシラジンを含む溶液の腹腔内注射で動物に麻酔をかけます。.0.25%ブピバカイン(8 mg / kg)を皮下注射して、痛みをさらに緩和します。.筋肉の緊張を監視し、痛みによる反射がないことを観察して、麻酔の深さを確認します。
- 頭の上の皮膚を剃り、70%アルコールで滅菌します。マウスを定位固定装置フレームに合わせます。
- メスを使って皮膚を切除し、高速(38,000rpm)ドリルで運動皮質の上の骨に1.2mmの穴を開けます。
- 付属のインジェクションピペットでシリンジを精密マニピュレーターのホルダーに取り付けます。縦向きのピペットを皮質の4つの異なる部位に挿入します。注入座標は、ブレグマ(mm)に対して、前方1.5、横方向1.56、1.8、2.04、2.28です。硬膜に対する深さは(mm単位):1.5〜1.7です。
- 注入システムを使用して、希釈されていないウイルス溶液のサイトあたり0.3μLを0.05μL / minの速度で注入します。各注入後、ピペットを1分間そのままにしてから、ゆっくりと(1 mm / min)引き出します。
- ナイロン縫合糸で手術創を閉じて仕上げます。
- マウスを元のケージに戻す前に、マウスを清潔なケージの加熱パッドに0.5〜1時間置いておきます。
- 急性脳スライスの調製前に、マウスを12時間の昼夜サイクルで6〜8週間維持します.
手記：免疫反応が細胞の損傷やシナプスの喪失を引き起こすのを避けるために、複数のウイルスコンストラクトの注射を同時に行うか、一次注射後2〜3時間以内に行う必要があります。iGluu インジェクションの座標は、Paxinos と Franklin の脳アトラスに従って選択されました。それらはM1運動皮質に対応します。注射された脳の免疫染色では、同側および対側線条体、および反対側のM1およびS1皮質に、多数あるがほとんどが十分に分離された軸索および軸索静脈瘤が視覚化されました。
2. グルタミン酸センサーiGluuを発現するグルタミン酸作動性末端の検索
- キャリブレーションモード
- sCMOSカメラとカメラ制御ソフトは、以下の設定でご用意ください。Readoutページでは、Pixel Readout Rate:560 MHz(=最速の読み出し)、Sensitivity/Dynamic Range:bit、Spurious Noise Filter:Yes、Overlap Readout:Yesを設定します。[ビニング/ROI] ページで、[全画面表示] を選択します。
- カバースリップの下に5 mg / mLルシファーイエロー(LY)を一滴入れたスライドガラスを準備します。.
- LYスライドを63倍対物レンズの下に置き、レーザーシャッターを開き、次の設定を使用して連続取得を実行します:ピクセルビニング:1x1、トリガーモード:内部、露光時間:最小(未定)。
- レーザー出力を調整して、直径4μmの蛍光スポットを生成します(画像に飽和ピクセルが含まれていてはなりません)。
- レーザー位置決めシステムのキャリブレーションを実行するには、レーザー位置決めソフトウェアで次の設定を選択します:スポットサイズ直径:10、スキャン速度:43.200kHz。右側のパネルにある[画像取得の開始]ボタンをクリックします。[Runs] を 0、[Run delay] を 0 に設定し、[Sequence] ページで [Run at TTL] オプションを選択します。キャリブレーションページのキャリブレーションボタンをクリックし、取得画面の左上隅に表示される指示に従ってレーザー制御ソフトウェアをキャリブレーションします。
- セットアップでカメラとレーザー制御に独立したソフトウェアを使用している場合は、カメラ取得ウィンドウからスクリーンショットを取得し、それをレーザー制御ソフトウェアに送信してXY座標を再計算します。ソフトウェアが異なるコンピューターにインストールされている場合は、ビデオグラバーを使用して画像をレーザー制御ソフトウェアにインポートします。レーザー制御ソフトウェアには、XYスケーリング係数とオフセットに関する情報が必要です。この目的のために、レーザー制御プログラムの取得ウィンドウ内で、画像の左上、左下、右下の隅の座標を決定します。次の式に従ってスケーリング係数を計算します:Xファクター=(X右下-X左下)/2048、Xオフセット= X左下、Yファクター=(Y左上-Y左下)/2048、Yオフセット=Y左下。
- キャリブレーション手順の最後に、267x460ピクセルの長方形の関心領域(ROI)を作成し、それを画面の中央に移動して、[シーケンスの開始]ボタンをクリックします。
- 次のカメラ制御ソフトウェアの設定に戻ります:ビニング:2x2、トリガーモード:外部露出、露出時間:最小(未定)。
- 自家蛍光補正モード
注:活性シナプス終末の環境における[Glu]の静止レベルは、通常100 nM未満です。したがって、グルタミン酸のセンサー、特にiGluuのような低親和性センサーは、シナプス性グルタミン酸の放出がないとかなり暗くなります。それにもかかわらず、一部のiGluu蛍光は安静時でも検出できますが、組織の自家蛍光とは区別する必要があります。473 nmの照明は、iGluu蛍光と自家蛍光の両方を引き出します(図1A–C)。後者は広範囲の波長を占めますが、iGluu蛍光は480〜580 nmに制限されています(最大は510 nm)。自家蛍光の補正は、異なるハイパスフィルターを使用した2つの画像の取得に基づいています。
- 他の場所で説明したように、事前に脳スライスを準備します。ふすまのスライスを準備しておいてください。
- スライスを記録チャンバーに移し、125 mM塩化ナトリウム(NaCl)、3 mM塩化カリウム(KCl)、1.25 mM二水素リン酸ナトリウム(NaH2PO4)、25 mM重炭酸ナトリウム(NaHCO3)、2 mM塩化カルシウム(CaCl2)、1 mM塩化マグネシウム(MgCl2)、10 mMグルコース(pH 7.3、303 mOsm / L)に、0.5 mMピルビン酸ナトリウム、2.8 mMアスコルビン酸ナトリウム、および0.005 mMグルタチオンを添加しました。1〜2 mL/minの流速を使用してください。浴の温度を28〜30°Cに保ちます。
- 背側線条体を20倍の水浸対物レンズの下に配置します。プラチナハープにナイロングリッドでスライスを固定し、組織の動きを最小限に抑えます。63x /NA 1.0水浸対物レンズに切り替えます。473nmの光を反射するフィルター(ダイクロイックミラー)と波長>510nmの光を通過させるフィルター(発光フィルター)を選定します。
- Analog-to-Digital(AD)/Digital-to-Analog(DA)(AD/DA)ボードとそれぞれの制御ソフトウェアを使用して、照明、刺激、画像取得を同期します。レーザー露光時間180ms、画像取得時間160msで取得を制御するようにトリガープログラムを設定します。レーザー位置決め装置を使用して、レーザービームを所定の数のポイントに送り、スキャン速度とスポットサイズの設定を定義します。
- 510 nmのハイパスフィルターを使用して、自家蛍光構造とiGluu陽性構造の両方の画像を取得します(「黄色の画像」)。
- 600 nmのハイパスフィルターを使用して自家蛍光のみで画像を取得します(「赤色画像」)。
- 赤と黄色の画像をスケーリングし、最も明るい 10 個のピクセルと最も暗い 10 個のピクセルの平均強度を使用して範囲を定義します。減算「黄色から赤の画像」を実行し、減算された画像を再スケーリングして標準の8ビットtifファイルを生成し、対象のボタンを簡単に視覚化します(図1D)。これには、iGluu-positive 構造体の明るいピクセル、背景の灰色のピクセル、自家蛍光の構造の暗いピクセルが含まれています.
手記：所定の装置を使用すると、平均静止蛍光(F)は700A.U.未満になります。
- ブートン検索モード
注:iGluu陽性ピクセルは、異なる順序の軸索枝、分岐部位、小胞枯渇後の静脈瘤、または完全に活性な静脈瘤など、軸索樹の機能的に異なる要素に属している可能性があります。しかし、目視検査だけでは機能的なシナプス終末を特定することはほぼ不可能です。したがって、各グルタミン酸作動性シナプス末端は、電気的脱分極に対する応答性によって識別する必要があります。刺激に反応しない部位は破棄する必要があります。皮質線条体軸索からのグルタミン酸放出を誘導する生理学的手段は、活動電位を誘発することです。これは、適切なスペクトル特性のチャネルロドプシンを使用するか、iGluu自体によって視覚化された軸索の電気刺激によって達成できます。偶発的なオプシンの活性化を避けるために、後者のアプロスターステップを好みました
- マイクロピペットプーラー(4ステップモード)を使用して、ホウケイ酸ガラスキャピラリーから刺激ピペットを作製します。先端内径は1μm程度としてください。ACSFを充填した場合、電極抵抗は約10MΩになります。
- 同じ軸索に結合した一連のシナプスボタンからグルタミン酸の活動電位依存性放出を誘導するには、63倍の倍率、510 nmの発光フィルター、および減算された画像を使用して、蛍光静脈瘤の隣にガラス刺激電極を配置します。追加の軸索の接近を避けてください。
- 刺激装置の電源を入れて、脱分極電流パルスを刺激ピペットに送達します。電流強度は約2μA(10μA以下)を使用してください。
- マルチチャンネルバスアプリケーションシステムをオンにすると、1つのチャンネルが標準的なバス溶液を送達し、もう1つのチャンネルがイオンチャネル、トランスポーター、または膜受容体の必要なブロッカーを送達します。記録部位で流れを制御してから、テトロドトキシン(TTX)チャネル(浴液と1μM TTX)に切り替えます。2〜3分後、関心のあるボタンを再度刺激しますが、今度は活動電位の生成がない場合です。この放出は、電圧依存性カルシウムチャネルを介したカルシウム流入に直接起因します。
- 刺激装置の強度キーを回すことにより、刺激電流を調整して、活動電位を介して引き出されるのと同様の応答を取得します。通常、0.5 msの脱分極の場合、刺激電流は約6 μAです。
- 調製物の基本的な試験のために、0.5 mM CdCl2を適用する。このカルシウムチャネル遮断薬であるグルタミン酸の放出の存在は、シナプス性グルタミン酸の放出を完全に防止し、それにより直接的に誘発されるグルタミン酸シグナルのカルシウム依存性を検証します><。
手記：以下の一般的な推奨事項は、線条体における単一シナプス実験の成功率を高めるのに役立つ可能性があります。無傷の放出機構を備えたグルタミン酸作動性シナプス終末を選択するには、静脈瘤は次のものでなければなりません:(i)滑らかな紡錘形のような形状をしています。(ii)軸索分岐部に関連していない。(iii)「黄色の画像」上の他の構造よりも明るくあること。(iv)線維路ではなく線条体神経孔に存在する。(v)非常に細い軸索枝に存在する。(vi) スライスの深い部分に存在しない。
3. グルタミン酸の放出とクリアランスの可視化
- 録音モード
注:自家蛍光の減算(ステップ2.2)と、目的のブートンの応答性に関するいくつかの初期テスト(ステップ2.3)の後、データ取得を開始できます。単一の軸索終末からのグルタミン酸放出の電気的活性化に対する応答は、追加の分析ツールを適用せずに、画像で直接観察できます(図2)。しかし、シナプスの基本的な指標をすぐに抽出することは非常に便利であることが証明されました(図3)。この情報は、特定の末端タイプの選択、HD関連の変化の迅速な評価、超融合システムに適用される試験または薬物の数と頻度など、その後の実験過程に関する決定を下すために必要です。また、最終的に現れるアーティファクトに対処する必要がある場合もあります。まず、データ記録の標準的な設定について説明します。
- 顕微鏡XYドライブを使用して、テスト済みのiGluu-positiveボタンを表示視野の中心近くに置きます。[取得の中止] ボタンで画像の取得を停止します。最後に取得した画像で、マウスの左ボタンでクリックして、静止しているボタンの中心のXY位置を決定します。設定されたカーソルのXY座標は、取得ウィンドウの下部のステータスパネルに表示されます。
- キャリブレーションデータ(ステップ2.1.6)を使用して、iGluu蛍光の励起のためにレーザービームを送信する場所の座標を計算します。次の方程式を使用します: X レーザー = X カメラ * X 係数 + X オフセット、Y レーザー = Y オフセット – Y カメラ * Y 係数。この再計算を実行するときは、カメラの垂直または水平の反転設定に注意してください。
- 計算された座標を使用して、レーザー制御ソフトウェアで1点シーケンスを作成します。このためには、レーザー制御ソフトウェアの[シーケンス]ページにある[シーケンスに追加]ボックスで[ポイント]を選択します。開始をトリガーする遅延に10 μsを、レーザーパルス時間に180 msを選択します。計算された座標にマウスを移動し、左ボタンをクリックします。
- レーザー制御ソフトウェアで次の設定を選択します:実行:0、実行遅延:0、シーケンス:TTLで実行。次に、[シーケンスの開始] をクリックします。
- カメラ制御ソフトウェアで、次の設定を選択します:ビニング/ ROIページで、画像領域:カスタム、ピクセルビニング:2x2、高さ:20、幅:20、左:静止しているiGluu-positiveスポットのX座標から10pxを引いたもの、下:静止しているiGluu-positiveスポットのY座標から10pxを引いたもの、取得モード:キネティックシリーズ、キネティックシリーズの長さ:400、露光時間:0.0003744s(最小値)。このような設定では、集録レートは2.48kHzになります。
- [トリガー モード] : [外部] を選択します。カメラ制御ソフトウェアの[信号を取る]をクリックします。トリガーデバイスに定められた実験プロトコルを開始します。
- 次のタイムラインで実験プロトコルTrialを実装します:0 ms - トライアル開始、1 ms - レーザー照明開始、20 ms - カメラによる画像取得開始、70 ms - 電気刺激開始1、120 - 電気刺激開始2、181 ms - トライアル終了(レーザーとカメラオフ)。したがって、1回の試行中に、カメラは2.48kHzの周波数で400フレームを取得します。手順 2.3.3 と 2.3.5 を参照してください。電気刺激の詳細については、こちらをご覧ください。
- シナプス前小胞プールの十分な回復を可能にするために、0.1 Hz 以下の繰り返し周波数でプロトコル トライアルを適用します。
- 病理学的シナプスの同定のためのグルタミン酸の一時的およびグルタミン酸放出およびクリアランスの迅速な評価のオフライン構築
- 評価ルーチンをオンにします。ここでは、自社で作成したソフトウェアSynBout v.3.2を使用しています。(著者:アントン・ドヴォルジャク)。図2のビデオのように、iGluu蛍光が上昇したピクセルからΔF/Fトランジェントを構築するには、次の手順が必要です。
- ブートンサイズを決定するには、刺激の開始前に、静止時のROI蛍光強度(F)の平均と標準偏差(SD)を計算します。ピクセルが占める領域をF>平均 + 3 SDで決定し、ボックス化します(図3A)。仮想直径 (μm 単位) を、閾値を超える領域の円形を仮定して決定します。
- ピーク強度値とFの差としてΔFを決定し、刺激電流とΔF/Fを時間に対してプロットします(図3B)。静止時(刺激の開始前)のΔF/FのSDと「ピーク振幅」を計算します。ピーク振幅がΔF/Fの3SDを超えるピクセルを使用して、ピークからの減衰の単指数フィッティングを実行します。ΔF/Fの崩壊TauDの時定数を決定します。
- 特定のシナプスでの「最大振幅」を推定するには、ΔF/F値が最も高いピクセルを選択します。これは通常、静止しているブートンiGluu蛍光の境界内または境界の隣に位置しています。「最大振幅」は、単一のシナプスのクリアランス機構に提示されるグルタミン酸負荷の最良の指標です。
