ラットの複数の部位からの脳活動のin vivo電気生理学的記録

要約

出典: Haumesser, J. K., et al. Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats. J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオは、麻酔をかけたラットを複数の部位からの脳活動の電気生理学的記録のために準備するための詳細な手順を示しています。頭皮を解剖して頭蓋骨にアクセスし、電極を取り付けて固定するために正確な位置に穴を開けます。次に、タングステンマイクロワイヤ電極を目標位置に挿入してデータを記録します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 手術

1. 電気生理学的記録には、麻酔にウレタン(CAUTION)を使用してください.
   注意：ウレタンは毒性があり、発がん性があるため、常に物質の製造業者が提供する安全規制とデータシートを遵守してください。
2. 200 mg / mLウレタンの溶液を0.9%塩化ナトリウム(NaCl)医療用生理食塩水に調製します。.
3. 合計 1.3 g/kg 体重のウレタンを腹腔内 (IP) に投与します。ラットの株によっては、麻酔の安全性を高めるために、注射の間隔を15分空けて用量を2回に分けることが合理的である場合があります。
4. ペダル離脱反射やその他の適切な反射神経を使用して、麻酔の深さを確認します。麻酔が手術を行うのに十分な深さでない場合は、0.15 g / kg体重のウレタンIPを注入し、さらに15分待ちます。
5. 角膜の脱水を防ぐために目の軟膏を塗ります。
6. 麻酔中は、呼吸数とペダル離脱反射を常に監視します。温度制御付きの小動物用ヒーティングパッドを使用して、手術中ずっと生理的な体温が維持されるようにします。電気生理学的記録を開始する前に、非電気的代替品(酢酸ナトリウムヘッドパッドなど)に変更してください。.
7. 頭の背側に沿って毛皮を剃ると、きれいな手術野が得られます。切開部位の周囲を適切な外科的消毒剤で消毒します。動物を定位フレームに固定します。
8. メスで頭皮を矢状方向に2cmの長さの切開を行います。メスを使って頭蓋骨の腱膜をわずかにこすり落とし、頭蓋骨を消毒します。3%過酸化水素(H₂O₂)に浸した綿棒を使用して、残っている組織をすべて取り除きます。
9. 必要に応じて、電気焼灼または熱焼灼器を使用して出血を抑制します。1〜2分後に出血が自然に止まらず、頭蓋骨の視力を妨げる場合は、頭蓋骨と皮下組織からの出血を止めます。
10. 頭が平らな頭蓋骨の位置、つまり定位固定基準点としてのブレグマとラムダが同じ平面にあるようになるまで、切歯バーを調整します。これは、高い手術精度を達成するために最も重要です。標準的なラット定位固定装置アライメントツールを使用し、顕微鏡視下で指定された先端をブレグマに較正し、ツール上のブレグマとラムダの指定されたポイントが同時に頭蓋骨に触れるまで切歯バーを調整します。
    手記： 一方の側からの眺めともう一方の側からの焦点の光が、この状態を判断するのに役立つ場合があります。あるいは、細いカニューレを備えた定位固定装置ホルダーを装着し、顕微鏡下でブレグマとラムダの背腹座標を測定します。Bregmaとlambdaの背腹座標が同じになるまで切歯バーを調整します。
11. カニューレ付きの定位固定ホルダーを使用し、ブレグマに合わせてキャリブレーションしてから、頭蓋骨のすべてのドリル穴の位置を計算します。脳定位固定装置ホルダーを使用して、頭蓋骨を慎重に引っ掻くか、外科用カラーマーカーを使用して、ドリルで開ける穴の位置をマークします。このための座標はターゲットによって異なります。表 1 の HyperDirect 経路については、bregma を参照する座標が示されており、これには小脳参照電極の推奨座標が含まれています。
12. マイクロドリルを使用して、すべての穴を慎重にドリルで穴を開けます。視床下核(STN)と黒質部網状(SNr)には、共通の穴(約2 mm x 3 mm)を開けます。他のすべてのドリル穴の直径は約1mmである必要があります。
13. 2つの細いカニューレ(少なくとも27 G)を取り、硬い表面またはピンセットを使用して、先端を曲げてフック状にします。これらを使用してドリル穴から破片を取り除き、一般的なSTN / SNr穴の硬膜を慎重に切断して取り外します。
14. ドリル穴を生理生理食塩水で洗い流します。ドリル穴に生理生理食塩水を15分ごとに一滴垂らして、脳と硬膜が乾燥するのを防ぎます。
15. マイクロドリルと対応するステンレス鋼のマイクロネジ(例:M 1.2 mm x 2 mmネジ)を取り、穴を開け、小脳の上の基準硬膜外電極のドリル穴の間にマイクロネジをねじ込み、M1硬膜外電極についても同じことを行います。
16. 自作のAg/AgCl硬膜外電極を、参照電極とM1電極のドリル穴にスライドさせます。電極の先端を細いピンセットでガイドし、頭蓋骨の真下にスライドさせてドリル穴に入れます。
17. すべての硬膜外電極を2液型歯科用アクリルで固定します。ブレグマポイントを覆ったり、一般的なSTN / SNr穴に影響を与えたりしないように注意してください。
18. タングステンマイクロワイヤー電極を装着した用意したホルダーを脳定位固定装置フレームに挿入します。
19. STNを標的とすることを目的とした最も腹側の電極をブレグマに較正します。一般的なSTN / SNr穴の上の計算された位置に調整し、顕微鏡視下で電極を脳まで下げます。タングステンマイクロワイヤー電極が脳内にスムーズに入ることを確認してください。

>2. 電気生理学的マッピングと録音

>注:このステップでは、ファラデーケージと、オンラインフィルタリングとオンラインスパイクソーティングが可能な記録ソフトウェアを備えたマルチチャネル電気生理学的記録システムが必要です。できれば、動物の頭の近くに配置されたプリアンプと連動するシステムを使用して、電気ノイズやアーティファクトを絶対的に最小限に保ちます。タングステンマイクロワイヤー電極の他に、ハイパーダイレクト経路の記録を行うには、少なくとも1つの硬膜外電極と1つの参照電極が必要です。硬膜外電極と参照電極は、互いに接触しないようにペアで挿入することが推奨されますが、これは誤動作の場合に役立ち、データ分析における異なるタイプの参照を可能にします。

1. 可動式ファラデーケージを脳定位固定装置フレームの上に置きます。固定式のファラデーケージしかない場合は、脳深部電極が脳内に下がらないようにしながら、固定装置フレームをファラデーケージに慎重に移動させます。
2. 電極を電気生理学的セットアップのヘッドステージに接続します。参照電極が適切な参照チャネルに接続されていることを確認してください。
3. 録音ソフトウェアのセットアップ:バンドパスフィルター(0.05-8,000 Hz)と amplify(1,500-2,000x)生データ信号を。適切な設定(LFPの場合はバンドパスフィルター0.05〜250 Hz、MUAの場合は300〜8,000 Hzのバンドパスフィルター)でオンラインLFPおよびスパイクフィルターを使用します。すべてのフィルターで、バターワースタイプのフィルターを使用します。
4. 該当する場合は、オンライン スパイク ソートのスパイクしきい値を設定します。ほとんどの録音ソフトウェアでは、ソフトウェアによって信号がスパイクとしてマークされる振幅値であるスパイクしきい値を設定できます。このしきい値は、フィルタリングされたスパイク信号の平均振幅の係数または標準偏差として数学的に決定するか、できればデータセグメント<500ミリ秒の目視検査によって決定し、グラフィカルユーザーインターフェイスで信号ノイズの上の線として設定することができます。
   手記：スパイクしきい値を設定する意図は、現在記録されているニューロンの数とそれらのスパイクがどのように形成されているかに関する情報を提供するために、スパイクをカウントし、ユニットを並べ替え
ることです。
5. タングステンマイクロワイヤー電極を、ハイパーダイレクト経路のSTNであるターゲットの背側1mmまでゆっくりと下げます。必要に応じて、信号が安定するのを待ちます。
6. 電気生理学的マッピングのためには、電極を100μm刻みで腹側に進めます。各ステップで、スパイクの発射パターン、発射率、形状を評価します。これらを図 1 に示す一般的な例と比較します。一般に、密集した核は、いくつかの背腹ステップで迅速かつ連続的なスパイクを示しますが、繊維が豊富な構造は、発火率が低く、その後の腹側ステップでのスパイク活性が均一でなくなっています。
7. ハイパーダイレクト経路の場合、最も腹側の電極がSTNの内部にあることを確認してください.
   手記：STNは、Zona incertaの腹側でMUAの大幅な増加が検出されたときに到達します。STNの腹側では、電極が内部カプセルに到達したため、スパイクはほぼ完全に停止します。最も腹側の電極がSTNにある場合、タングステン微小電極の構成により、後部の第2の電極がSNrにあることが保証されます。MUAの頻度は、実際に記録されたニューロンの数と脳の活性化のレベルに依存することに注意してください。
8. 電極が目的の構造になったら、オンラインフィルタリングとスパイクソーティングを設定し(図2を参照)、データの記録を開始します。LFP記録で識別できるさまざまな皮質同期状態の典型的な例を図3に示します。

>表1:超直接的な皮質-大脳基底核経路の記録のための定位座標。すべての点は、頭蓋骨のブレグマ基準点からmm単位で測定されます。N.A.- 該当しません。

の

Bregmaからの座標	駅	SNrの	M1	参考1	参考2
前後	△3.6	△4.8	+3.0	-10.0	-10.0
内側外側	+2.5	+2.5	+3.0	+3.0	△3.0
背側-腹側	△8.0	N. A.	N. A.	N. A.	N. A.

結果

図1:STNを標的とする背腹側電極の軌道からの特徴的なマルチユニット活動。(A)腹側後内側視床核(VPM)、内帯(ZI)、視床下核(STN)、および黒質網状筋(SNr)のマルチユニット記録。VPMは、まばらで不規則な間隔の高振幅スパイクを示します。このスパイクのパターンは、ZI に近づくと止まります。電極がSTNに入ると、中程度の振幅で短いバーストを伴う典型的な高周波の発射パターンが観察されます。SNrは、その高振幅と規則的な発射パターンによって識別できます。(B)ラット定位アトラス21からの画像に重ね合わせたSTN軌道。上部:冠状面。下部:矢状面。電極チップがVPMとZIを通過することに注意してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Ag/AgClカスタム硬膜外電極	Goodfellow GmbH D-61213 バート・ナウハイム, ドイツ info@goodfellow.com	99.99%銀線の商品ID AG005127	Ag/AgCl電極は、より優れた信号品質を可能にしますが、急性実験でのみ使用できます。交換可能:ステンレス鋼電極
アクリルブロック付き脳定位固定装置ホルダー	デビッド・コップ・インスツルメンツ、 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042 アメリカ合衆国	製品ID: Model 1770 標準電極ホルダー	アクリルブロックに、目的のターゲットの電極設定に適したくぼみがあることを確認してください。アクリルブロックは、ファイルで簡単に変更して、目的の構成にすることができます。交換可能:自作電極ホルダー
タングステンマイクロワイヤ電極 1.5MΩインピーダンス	Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, メリーランド州, 20879 アメリカ合衆国	製品ID: WE3ST31.5A5-250um	1.5MΩは、MUAとLFPを同時に記録するために必要です。交換可能:異なる材料の微小電極を使用することができます。電極は、まっすぐで、堅牢で、できるだけ薄くなければなりません。
ラットアライメントツール	デビッド・コップ・インスツルメンツ、 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042 アメリカ合衆国	製品ID: モデル944、ラットアライメントツール	脳の正確な向きを脳定位アトラスと一致するようにすることができます。交換可能:カニューレ付き脳定位固定装置ホルダー
2液型歯科用アクリル	アソシエイテッドデンタルプロダクツ株式会社 Kemdentワークス、パートン、スウィンドン ウィルトシャー, SN5 4HT イギリス	シンプレックスラピッドパウダークリア225g、製品コード:ACR803;シンプレックス ラピッドリキッド 150ml 商品コード:ACR920	使用する電極によっては、電極が小さく軽量であれば、瞬間接着剤が簡単な代替品となる場合があります。代替品:瞬間接着剤(シアナクリレートベース)
ファラデーケージ	セルフコンストラクション		適切なファラデーケージは、電磁アーティファクトからの最善の保護となりますが、箱の形に形成したり、フレームに適用したり、導電性材料でできているものはすべて役立つ場合があります。可能な交換:アルミホイルまたは銅メッシュ
記録ソフトウェアとオンラインスパイクソーティング機能による電気生理学的セットアップ	OmniPlex® ニューラルデータ収集システム プレクソン株式会社 6500グリーンビルアベニュー、スイート700 テキサス州ダラス75206 米国		オフラインソートソフトウェアは潜在的な代替手段であり、オープンソースコミュニティでは複数のスクリプトとソフトウェアを無料で見つけることができます。