電位感受性色素で染色された脳切片における神経活動の光学的記録

要約

出典:Tominaga, Y., et al. Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオは、電位感受性色素で染色された脳スライスのニューロン活動の変化を観察する手順を示しています。この色素は、ニューロンの蛍光強度を変化させることにより、ニューロンの膜電位の変化を反映しています。このプロセスでは、電気刺激と高度なイメージング技術を応用することで、VSD蛍光に基づく神経膜電位のリアルタイムな変化を視覚的に追跡することができます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 実験装置の日々の準備

1. 電源を入れます amplifier、コンピューター、およびカメラシステム、およびソフトウェアが実行されていることを確認します。
2. 人工脳脊髄液(ACSF)を50mLのチューブに入れ、カルボゲンで泡
立てます。
3. 蠕動ポンプを使用してACSFを循環させます。流速を約1mL/minに調整します。
4. 吸引ピペットの高さを調整して、実験室内の液面が常に一定になるようにしてください
   手記： 溶液のレベルは安定した記録を得るために重要であるため、調整はマイクロマニピュレータを使用して行う必要があります。
5. 3 M KCl寒天(2%)を充填した黄色のチップで構成された接地電極を、少量の3 MKl溶液を含むAg-AgClワイヤーを備えたホルダーに取り付けます。
6. ガラス電極(外径1mm、マイクロピペットプーラーで引っ張った内径0.78mm)に少量のACSF(体積の約3分の2)を、先細りの細いチューブの黄色い先端を使用して充填し、電極ホルダーに入れます。
7. マニピュレーターに取り付けられているロッドにホルダーを取り付けます。アンプを使用して、電極抵抗が約1MΩ.
   であることを確認してください。 手記：ロングシャンクワイド開口(4-8μm開口)のパッチタイプ電極は、フィールドレコーディングや刺激電極として適しているはずです。

2. 録音セッションの開始

1. 鉗子で湿ったチャンバーからスライス調製物を取ります。
2. スライスを顕微鏡下の実験チャンバーにすばやく置きます(図1)。
3. リングの端をシリコンOリングにしっかりと押し込みます。メンブレンや実験チャンバーの底を壊さないように注意してください.
   手記：スライスの方向は、視野内の刺激電極および記録電極の方向に関して考慮する必要があります。健康なスライスはメンブレンフィルターにくっつく必要があるため、ウェイトやナイロンメッシュなどの他のデバイスを使用してスライスを固定する必要はありません。
4. 刺激電極の先端と電界電位記録電極を透過光で顕微鏡下のスライスに置きます。
5. 電気生理学的記録システムを使用して、応答を確認します。通常の(染色されていない)電気生理学的記録を所定の構成で確認します.
   手記：記録電極は省略できますが、スライスの生理機能を確認するのに役立ちます。
6. 5倍水浸対物レンズと1x PLAN APOチューブレンズを使用して10kHzでサンプリングする場合、励起光強度をカメラの最大容量の約70〜80%に調整し、試料で13〜15 mW / cm²に対応します。励起光の波長は530nmで、発光フィルターは590nm>必要があります
   手記：シャッターを使用して、励起光の量を最小限に抑えます。連続して光を当てると、スライスの生理機能が劣化する可能性があります。光の潜在的な有害な影響は、光の強度と持続時間によって異なります。電気生理学的記録を使用して、光の影響を判断します。強度が13〜15 mW / cm²の場合、約1秒の露出が許容範囲の上限である必要があります。
7. 波長によってピントが合う場合があるため、蛍光灯を使用した取得システムでピントを調整し、取得を開始します。
8. 画像取得ソフトウェアでデータを調べます.
   手記：詳細な解析には、数値解析ソフトウェアのオリジナルマイクロプログラミングパッケージを使用しました。

結果

図 1. スライス調製物からの光信号の記録システム。(A)現在の原稿のスライスを画像化するために使用された顕微鏡の写真。光学系は対物レンズ(5x NA0.60)、ダイクロイックフィルター用ミラーボックス(580nm)、プロジェクション(チューブ)レンズ(PLAN APO×1.0)で構成されています。プロジェクションレンズの上部には、Cマウントを介してハイスピードカメラが取り付けられています。もう一つ、観察用の通常のUSBカメラがあります。励起光は光ファイバーを使用して導入されます。(B)ミラーボックスと互換性のあるレンズの写真。(C)記録システムの概略図。イメージングシステムと電気生理学的記録システムはPCで制御されます。光源には、フォトダイオードフィードバック制御システムを備えたLED照明シス...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
高速画像取り込みシステム	ブレインビジョン株式会社	MiCAM - ウルティマ	イメージングシステム
高速画像取り込みシステム	ブレインビジョン株式会社	MiCAMの02	イメージングシステム
広視野イメージングのためのマクロシナリオ	ブレインビジョン株式会社	THTマクロスコープ	マクロスコープ
フォトジオドードスタブリライザーを備えた高出力LED照明システム	ブレインビジョン株式会社	LEX-2Gの	LED照明
画像取り込みソフトウェア	ブレインビジョン株式会社	BV-anaの	画像取り込みソフトウェア
多機能電気刺激装置	ブレインビジョン株式会社	ESTM-8	刺激アイソレータ+AD/DAコンバータ
スライス支持体用メンブレンフィルター	Merk Millipore Ltd., MA, USA (米国マサチューセッツ州)	オムニポア、JHWP01300、0.45μmの細孔、	メンブレンフィルター/ 0.45 13
数値解析ソフトウェア	Wavemetrics Inc., OR, 米国	イゴルプロ	分析ソフトウェア
刺激アイソレーター	WPI株式会社	A395	刺激アイソレーター
AD/DAコンバーター	インストルテック	ITC-18 (英語	AD/DAコンバーター
電圧感受性色素 Di-4-ANEPPS	Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA (米国マサチューセッツ州ウォルサム)	カタログ番号:D-1199	VSD:Di-4-ANEPPS
ポリエトキシル化ヒマシ油	シグマ・アルドリッチ	クレモフォアELC5135	ポリエトキシル化ヒマシ油

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