マウスの嗅覚ニューロンの穿孔パッチクランプ記録

要約

出典:Jarriault, D., et al.無傷の神経上皮におけるマウス嗅覚ニューロンの穿孔パッチクランプ記録:同定された匂い受容体を発現するニューロンの機能分析。J. Vis. Exp.(2015年)。

このビデオは、穴あきパッチクランプ技術を使用して、マウスの嗅覚ニューロン(OSN)の電気生理学的記録を示しています。蛍光色素にタグされた匂い受容体を持つOSNを含む嗅上皮は、マウスから単離され、記録チャンバーに固定されます。記録ピペットはOSNの樹状突起ノブに固定され、ピペット内のナイスタチンがメンブレンを穿孔して細胞との電気的接続を形成します。最後に、別のピペットを使用して臭気刺激剤を送達し、パッチを当てた細胞の電気生理学的活性を記録する。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 動物

1. ジャクソン研究所で入手可能な遺伝子改変OR-IRES-tauGFP(OR=嗅覚受容体、IRES=内部リボソームエントリーサイト、tauGFP=タウ緑色蛍光タンパク質)マウスを使用してください。これらのマウスは、嗅覚系の軸索ターゲティングと発達を解析するために、ピーター・モンバエルツ博士の研究室で開発されました。たとえば、MOR23-IRES-tauGFPライン(ストック番号006643)には、正式な株名B6が付けられています。129P2-OLFR16TM2ママ/ママJ;同様に、SR1-IRES-tauGFPライン(品番6717)は正式名称B6です。129P2-OLFR124TM1ママ/ママJ.
2. 動物の年齢について:プロトコルのより良い結果を得るために、生後2〜4週齢の動物を使用してください。この年齢層では、解剖が容易(骨が柔らかく、嗅上皮が硬い)し、樹状突起のこぶは年配の動物に比べて大きいです。

2. 電極と溶液の調製

1. 刺激ピペットの場合:事前に引っ張られた刺激ピペットを購入します。それ以外の場合は、手動で準備します。
   1. 1mmガラス製ピペット6本を炎で先端から約1cmのところに曲げます。これらの6本のピペットと、アイレットで強化されたストレート7インチ1.5cm熱収縮チューブを挿入します。
   2. 熱によりチューブが収縮し、バレルが互いに取り付けられた状態が維持されます。追加の熱収縮チューブをバレルのもう一方の端に取り付けます。この刺激的なピペットをマルチバレルプーラーで引っ張ります。
   3. アイレットの周りに白い液体接着剤を追加して、曲がった先端を強化します。一晩乾燥させます(O / N)。
2. 1 Lまたは2 Lの正常リンゲル細胞外溶液(mM:NaCl 124、KCl 3、MgSO₄ 1.3、CaCl₂ 2、NaHCO₃ 26、NaH₂PO₄ 1.25、グルコース15、pH 7.6および305 mOsm)を調製します。使用するまで4°Cに保ちます。
3. 細胞内ストック溶液(mM)を調製する:KCl 70、KOH 53、メタンスルホン酸30、エチレングリコール四酢酸(EGTA)5、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)10、スクロース70;pH 7.2(KOH)および310 mOsm。使用するまで4°Cに保ちます。数週間有効です。
4. ナイスタチンを含む細胞内記録溶液を実験前に即刻(土壇場で)調製します。
   1. ナイスタチン3 mgを秤量し、ジメチルスルホキシド(DMSO)50 μlを加え、ボルテックス20秒後、完全に希釈されるまで2〜3分間超音波処理します。
   2. 5 mLの細胞内ストック溶液に20 μlのDMSO-ナイスタチン溶液を加えます。ボルテックス20秒、次いで3分間超音波処理する。この溶液を4°Cに保ち、直射日光から保護すると、ナイスタチンは光に敏感です。このソリューションは数時間使用できます。毎日交換してください。
   3. 嗅上皮の調製物を顕微鏡下に置いたら、この溶液の一部を1 mLのシリンジに入れ、先端が炎状に細長い黄色の電極を充填し、直射日光から保護します。室温(RT)になると、ナイスタチン溶液は安定しません。1時間ごとに1mlの注射器に溶液を交換するか、氷に保管してください。.
5. プラーで記録電極を引っ張ると、内部ナイスタチン溶液で15〜20MΩの抵抗を持つ長いネックと小さな先端(~2μm)が得られます。
6. ヒュームフードの下のDMSOで0.5 Mのところに臭気液を調製し、使用するまで-20°Cで保存してください。臭気物質をリンガー溶液で希望の濃度になるまで希釈します。刺激ピペットを満たします。

3. 嗅覚上皮の調製

>注:OR-IRES-tauGFPマウスは、ORプロモーターの制御下でtauGFPを発現します。これらのマウスでは、目的のORを発現するすべてのニューロンにGFPを標識しています。このプロトコルは、すべてのゾーンで表現されるORに適合しています。ただし、背側ゾーンで発現するORの場合、解剖と記録が容易になります。

1. ケタミンとキシラジンの混合物(それぞれ150 mg / kgおよび10 mg / kg体重)を注射して動物に麻酔をかけます。斬首は、若いマウスの場合は鋭利なハサミで、古いマウスの場合は適切に維持されたげっ歯類のギロチンを使用して実行できます。
   1. リング解剖ハサミを使用して、背側の皮膚を縦方向の内側に切開します。皮膚を引き離して取り除きます。ハサミを使って、顎の関節部で下顎をカットします。歯と平行に冠状に切って上の前歯を取り除きます。
   2. 目の後ろで頭の冠状切開を行い、頭の前部だけを保ちます。氷冷したリンガー溶液に浸して、スコープ下で解剖します。
2. スコープの下で解剖します:腹側で、上顎/歯に沿って縦方向に切り込みを入れます。鼻腔の背外側に沿って、背骨を縦方向に切断します。ほとんどの骨と口蓋を取り除きます。中隔とそれに付着した上皮をRTの酸素化リンガーに移します。
3. 最後の解剖の場合:録音セッションを開始する直前に、鉗子で下にある中隔から上皮を剥がします。鉗子と2つの4〜5 mmのはさみカット(マイクロバンナはさみを使用)で上皮を剥離します。
   1. 鋤鼻器官を中隔上皮への背側接続に沿って切り取ることにより、鋤鼻器官を慎重に取り除きます。上皮を粘液層を上に向けて記録室に移します。ハープでチャンバー内で平らに保ちます。
4. 蛍光光学系と高感度カメラを備えた正立顕微鏡の下にチャンバーを設置します。40倍の水浸対物レンズ(開口数0.8)と拡大レンズによる追加の2倍または4倍の倍率により、コンピューター画面上で高倍率で調製を視覚化します。酸素化リンガーを室温(1〜2 ml /分)で連続的に灌流します。

4. レコーディングセッション

1. 蛍光細胞の探索:530-550 nmの範囲で光を放出するEGFPに対して、480 nmで調製物を励起し、蛍光および明視野下で確実に見える樹状突起ノブを1つ標的とする。
2. 電極をナイスタチンを含む細胞内溶液で満たし、電極を軽くたたいて気泡を取り除きます。.
3. 電極ホルダーに電極を挿入し、ピペットに正圧を加えます。抵抗は15〜20MΩである必要があります。
4. 電極をセルに近づけ、抵抗が~40MΩに達したら、正圧を解放し、わずかな負圧を加えてギガシールに到達します。
5. シールに達したら、膜電位を約-75mVに設定します。
6. 細胞が開いたら、刺激プロトコル、薬理学的治療を進めます。単一の匂い刺激に対する応答を測定するには、200〜500ミリ秒の自発的な活動を記録し、500ミリ秒の刺激を行い、最大10秒間の細胞の応答を測定します。薬理学的治療のために、所望の濃度で薬理学的薬剤を灌流する。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
重機
ファラデーケージ付き振動台	TMCの	63-500シリーズ	必要:環境によって引き起こされる振動(実験者の動き、冷却コンピュータ用のファンなどの機器の振動など)から記録システムを分離します。また、ファラデーケージと一緒に購入することも、カスタムメイドのファラデーケージを装備することもできます。このケージは、環境からの電気ノイズを避けるために推奨されます
光学
顕微鏡	オリンポス	BX51WI	落射蛍光を備えた直立型マイクロコープ、ユーザーの好みに応じて固定ステージまたは可動ステージ
目標	オリンポス	LUMPLFL40XW	少なくとも2つの対物レンズが必要です:細胞への粗いアプローチ用の4倍または10倍、および40倍の液浸長距離の例Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
拡大鏡	オリンポス	U-TVCACの	絶対に必要:対物レンズとカメラの間の光路に配置され、記録電極でノブに正確に到達するために画面上の画像を拡大することができます
カメラ	オリンポス	DP72	蛍光性および明視野中のニューロンを見るためには、優れたカメラが必要である;制御ソフトウェアは単純で、写真を撮ったり、細胞への電極の接近を監視するためのライブカメラ画像を作成したりすることができる。超高感度カメラは必要ありません
フィルター	オリンパス/クロマ		マウスに用いる蛍光タンパク質により異なる;GFPの例:励起:BP460-490:発光:HQ530/50m
記録電極/システム
増幅器	ヘカ	EPC10 USB対応	記録電極を流れる電流を監視し、TTL信号をスプリッツァーに送ることでパフを制御します。EPC10のセットアップは コンピュータによる制御
ソフトウェア	ヘカ	パッチマスター	実験中にアンプを制御します
マイクロマニピュレーター	サッター	MP225	精密マイクロマニピュレータは、マイクロメートルの1/10までの正確な動きを可能にします。このモデルは非常に安定しています。ドリフトする可能性のある油圧マニピュレータを避けてください
電極プーラー	サッター	P97	FT345-B幅広トラフフィラメントを使用;細胞に到達するための長い先端を持つ直径約2μmの記録ピペットを準備する;抵抗は穴あきパッチクランプ溶液で15〜20MΩである必要があります
グラス	サッター	BF120-69から10	私たちの録音条件では、このグラスはピペットの記録に最適です
録音室	ワーナー・インストゥルメンツ	RC-26Gの	顕微鏡下で調製物をセットするためのチャンバーが必要です。チャンバーの中央で調製を維持するために、ネット/アンカーを使用する必要があります。
刺激
グラス	WPIの	TW100F-4	7つのグループで取り付けられたこれらのピペットは、事前に引っ張られた刺激ピペットを準備するために使用されます
マルチバレルプーラー	MDIの	PMP-107-Z	プルとツイストの関連付けにより、このプーラーは7つのバレルを備えたパフ電極を準備することができます
精密圧力インジェクター	トゥーイーカンパニー	P/N T25-1-900 シングルチャンネル	この精密圧力インジェクターは、マルチバレルプーラーで排出される圧力を制御します。手動またはアンプによって5V TTLによって制御されます
マイクロマニピュレーター	成茂	YOU-1 (あなた 1	粗いマニピュレータは、パフ電極を記録サイトに近づけるのに十分
チューブ
ソリューション/灌流/化学薬品
真空ポンプ	ガードナーデンバー
灌流システム	該当なし	該当なし
ナイスタチン	シグマ・アルドリッチ	N3503	穴あきパッチクランプの内部ソリューションをperpareするために必須
ジメチルスルホキシド	シグマ・アルドリッチ	D5879	穴あきパッチの内部溶液のナイスタチンを溶解するために使用されます
塩化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S9625	細胞外溶液
塩化カリウム	シグマ・アルドリッチ	P4504	細胞内/細胞外溶液
塩化カルシウム二水和物	シグマ・アルドリッチ	C7902	細胞外溶液
リン酸ナトリウム一塩基性一水和物(NaH2PO4)	シグマ・アルドリッチ	S9638	細胞外溶液
硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4 7H2O)	シグマ・アルドリッチ	63140	細胞外溶液
グルコース	シグマ・アルドリッチ	G8270	細胞外溶液
炭酸水素ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S6297	細胞外溶液
EGTA(エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N、N、N'、N'-四酢酸)	シグマ・アルドリッチ	E3889	内部ソリューション
ヒドロキシドカリウム	シグマ・アルドリッチ	P1767	内部ソリューション
メチルスルホキシド	シグマ・アルドリッチ	W387509	細胞内溶液
ヘペスナ	シグマ・アルドリッチ	H7006-J	細胞内溶液
蔗糖	シグマ・アルドリッチ	S0389	細胞内溶液

シリーズ の ) です 型 の シリーズ