出典:Martianova, E., et al.自由に動く動物の神経活動を記録するマルチファイバー測光。J. Vis. Exp.(2019年)。
このビデオでは、繊維測光を使用して自由に動くマウスの神経活動を記録する方法を示します。この方法では、特定の脳領域のニューロンが遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターを発現します。この脳領域に刺激を加え、刺激依存的な蛍光の変化を測定して神経活動を特定します。
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方法論記事
繊維測光法による自由自在に動くマウスの神経活動の記録
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. CMOS(相補型金属酸化膜半導体)カメラと個別または分岐するパッチコードとの間の光路のアライメント
- 5軸トランスレータのすべてのネジを緩めます(図1B)。
- パッチコード(図1B)を、5軸トランスレータに取り付けられているアダプター[SMA(サブミニチュアA)またはFC(光ファイバーコネクタ)]にねじ込みます。
- 470 nmの励起ライト(図1B)を低電力(100 μW)でオンにし、パッチコードの先端を自家蛍光プラスチックスライドに向けて置きます。これは、将来の録音には関係なく、アライメントプロセスを視覚化するためだけのものです。
- CMOSカメラ(図1B)からライブモードで記録します。ゲインを上げるか、画像が完全に黒くなくなるまでルックアップテーブル(LUT)を調整します。ポイントは、対物レンズの焦点で画像を見ることができるようにすることです(図1B)。
- 5軸トランスレータを対物レンズに向かって進め、470 nmの光がパッチコードのSMAまたはFC端のファイバーの中心にあることを確認し、カメラで画像を解決できるようにします。
- 画像が中央に配置され、適切に解決されるまで、X 軸と Y 軸を調整します。
- パッチコードのフェルール端から放出される光を視覚化します。等方性の円として表示されるはずです。分岐パッチコードを使用する場合、各パッチコードのフェルール端から放出される光の量は同程度である必要があります。円が等方性でない場合、または放出される光が等しくない場合は、X-Y 軸の 5 軸トランスレータを調整します。
>2. 平均蛍光強度を測定するための繊維周りのROIの設定
- すべての励起ライトをオンにして、ファイバーをよりよく視覚化します。ピクセルが飽和せず、ファイバーの鮮明な画像が存在するように、カメラゲインを調整します。
- ライブ録音または予備的な画像を撮ります。
- ファイバーの周囲にROIを描画し、記録中の平均強度値を測定するために保持します(図1A)。
- 複数のファイバー録音の場合は、信号の独立性をテストします。
- すべてのファイバーからのライブ録音。
- 1本のファイバーを光源に向け、指でタップします。大きな変動は、そのチャネルでのみ発生します(許容可能な漏れ1:1000)。
- 信号が独立していない場合は、より保守的なROIを再描画し、独立性テストを繰り返します。
- どのROIがどの繊維、色付きテープ、またはマニキュアを繊維の端に塗布できるかにラベルを付けて追跡します。実験を開始する前に、二次的なリマインダーとして写真を撮ります。
3. レコーディングアリーナのセットアップ
- スタンド、クランプ、またはホルダーを使用して、パッチコードをアリーナの上に吊るします。
- 動物が繊維の長さに妨げられることなく、アリーナ全体を自由に動き回れることを確認してください。
- オペラントボックスまたはオープンフィールドを使用する場合は、パッチコードが最小限の曲げで動物に到達できることを確認してください。ノーズポークが必要な場合は、ファイバーの曲がりを防ぐために、頭上に十分なスペースがあることを確認してください。パッチコードを過度に曲げたりねじったりしないでください。
4. 生体内記録
- パッチコードの繊維の遠位端を目視およびミニファイバー顕微鏡で検査します。繊維の表面に傷がついた場合は、砥粒(1μm、0.3μm)の繊維研磨・ラッピングフィルムで繊維を再研磨します。
- パッチコードの遠位端を70%エタノールと綿の先端アプリケーターで清掃します。
- 70%エタノールと綿の先端アプリケーターを使用して光ファイバーカニューレを清掃します。
- パッチコードのフェルール端を、黒色のシュリンクチューブで覆われたセラミックスプリットスリーブを使用して、埋め込まれたファイバーに接続します。接続中はスリーブがしっかりと締まっていることを確認してください。それ以外の場合は、新しいスリーブを使用してください。
手記：パッチコードフェルールとインプラントの間にスペースがあると、大量の信号損失が発生し、録音が機能しません。 - 行動試験の開始前に、動物が数分間回復するのを待ちます。
- 光信号の記録を開始し、実験を実行します。
- 録音中は、高品質の録音を確保するために、ライブトレースに注意してください。信号は、録音の最初の 2 分間で時間の関数として急速に減少すると予想されます。この効果は、熱によるLEDの減衰によって引き起こされ、熱の増加により光学素子の抵抗が増加します。
- GCaMPのオン/オフキネティクスを超える信号のジャンプが発生した場合、これは多くの場合、スリーブが十分に締まっておらず、パッチコードとインプラントの間のスペースが変化していることを示しています。この場合、実験を停止し、新しいスリーブを使用して動物を再接続します。
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結果
図1:ファイバー測光の概略図。 (A)2つのLED(410nmと470nm)からの励起光は、一連のフィルターとダイクロイックミラーを通過し、20倍対物レンズの作動距離に励起スポットを生成します。光は、埋め込まれたカニューレに接続された単一のパッチコードまたは束ねられたファイバー(複数部位の記録用)を通過します。放出された蛍光は、同じファイバーによって収集され、フィルタリングされ、CMOSカメラセンサーに投影されます。キャプチャされた画像では、平均蛍光強度が各ファイバーのROIで記録されます。時分割多重化は、410nmと470nmの両方のLEDから同時に信号を取得するために実装されています(右下の図)。(B)カスタムメイド測光システムとその構成部品のイメージ:(1)465nm LEDへのファイバー、(2)405nm LEDへのファイバー、(3)コリメータ、(4)470nmバンドパスフィルター、(5...
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1/4 "-20ステンレス鋼キャップスクリュー、1"長 | ソーラブ | SH25S100 | |
| 1/4 "-20ステンレス鋼キャップスクリュー、1/2 "ロング | ソーラブ | SH25S050 | |
| 1/4 "-20ステンレス鋼キャップスクリュー、3/8 "ロング | ソーラブ | SH25S038 | |
| 1000 μm、0.50 NA、SMA-SMA ファイバーパッチケーブル | ソーラブ | M59L01 | |
| 12.7mmオプティカルポスト | ソーラブ | TR30/M | |
| 12.7mm台座ポストホルダー | ソーラブ | PH20EM | |
| 15 V、2.4 A電源ユニット、 T-Cube用3.5mmジャックコネクタ | ソーラブ | KPS101 | |
| 20倍対物レンズ | ソーラブ | RMS20Xの | |
| 30 mm ケージキューブ、ダイクロイックフィルターマウント付き | ソーラブ | CM1-DCH/M | |
| 405nmのLED | ドーリックレンズ | CLED_405 | |
| 410nmバンドパスフィルター | ソーラブ | FB410-10 | |
| 465nm。LED製品 | ドーリックレンズ | CLED_465 | |
| 470nmバンドパスフィルター | ソーラブ | FB470-10 | |
| 560nmバンドパスフィルター | セムロック | FF01-560/14-25 | |
| 560 nm LED | ドーリックレンズ | CLED_560 | |
| 5軸キネマティックマウント | ソーラブ | K5X1 | |
| アクロマティックダブレット | ソーラブ | AC254-035-A-MLの | |
| 405コリメータ用アダプタ | ソーラブ | AD11F | |
| 調整可能なコリメータ用アダプタ | ソーラブ | AD127-Fの | |
| アルミブレッドボード | ソーラブ | MB1824 | |
| クランプフォーク | ソーラブ | CF125 | |
| キューブ コネクタ | ソーラブ | CM1 - CC | |
| デュアル493/574ダイクロイック | セムロック | FF493/574-DI01-25x36 | |
| GCaMP6用蛍光フィルター | セムロック | FF01-535/22-25 | |
| 黒のハードボードパネル付きエンクロージャー | ソーラブ | XE25C9 | |
| 機械加工用の外部SM1ネジ式エンドキャップ | ソーラブ | SM1CP2M | |
| ファストチェンジSM1レンズチューブフィルターホルダー | ソーラブ | SM1QPの | |
| 405nm光用固定コリメータ | ソーラブ | F671SMA-405 | |
| 470nmおよび560nm光用の固定コリメータ | ソーラブ | F240SMA-532 | |
| グリーンエミッションフィルター | セムロック | FF01-520/35-25 | 光線スプリッター |
| 高解像度USB 3.0 CMOSカメラ | ソーラブ | DCC3260M | |
| 光線スプリッター | ニューロフォトメトリクス | 割る | |
| ロングパスダイクロイックミラー、425 nm カットオフ | ソーラブ | DMLP425R | |
| ロングパスダイクロイックミラー、495 nm カットオフ | セムロック | FF495-DI03 | |
| メタボンド歯科用セメント | C&Bの | ||
| M8 - M8 ケーブル | ドーリックレンズ | Cable_M8-M8 | |
| 光ファイバーカニューレ | ドーリックレンズ | これらを低自家蛍光を必要とする測光実験に使用することを明記する必要がある | |
| 光ファイバーパッチコード | ドーリックレンズ | これらを低自家蛍光を必要とする測光実験に使用することを明記する必要がある | |
| 赤色の発光フィルター | セムロック | FF01-600/37-25 | 光線スプリッター |
| T7 Labジャック | Labジャック | ||
| T-cube LEDドライバー | ソーラブ | LEDD1Bの | |
| USB 3.0 I/Oケーブル ヒロセ電機25 DCC3240用 | ソーラブ | キャブ-DCU-T3 |
