マウス脳切片における網膜形成型および皮質形成型シナプスの電気生理学的研究

要約

出典:Chen, X., et al.網膜形成性および皮質性シナプス機能の電気生理学的研究。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、マウスの脳スライスにおけるレチノゲン酸シナプスとコルチコゲン酸シナプスの電気生理学的記録について説明しています。背側外側膝状核(dLGN)を含むスライスは、記録チャンバーに入れられます。刺激ピペットは、網膜神経節細胞(RGC)を刺激して網膜性シナプスを調査するための視路または皮質ニューロンを刺激して皮質性シナプスを調査するための視床網核のいずれかに配置されます。刺激を受けると、RGCと皮質ニューロンは興奮性神経伝達物質を放出し、LGNリレーニューロンにシナプス電流を生成します。これらの電流は、パッチクランプ記録ピペットを使用して記録されます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. ソリューション

1. 解剖ソリューション
   1. 興奮毒性を低減するために、ここに示されているように、解剖中に使用されるコリンベースの溶液を準備します(mM単位):87 NaCl、2.5 KCl、37.5 choline chloride、25 NaHCO₃、1.25 NaH₂PO₄、0.5 CaCl₂、7 MgCl₂、および25グルコース。実験の1週間以内に解剖液を準備します。
2. 録音ソリューション
   1. 125 NaCl、25 NaHCO₃、1.25 NaH₂PO₄、2.5 KCl、2 CaCl₂、1 MgCl₂、および25グルコースを含む人工脳脊髄液(ACSF)溶液を調製します(mM)。50 μM D-2-アミノ-5-ホスホ吉草酸(D-APV)と10 μM SR 95531臭化水素酸塩(ガバジン)をそれぞれ添加して、N-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)およびGABAA受容体をブロックします。
3. 細胞内溶液
   1. 35 Cs-グルコン酸、100 CsCl、10 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、10 エチレングリコール四酢酸(EGTA)、および0.1 D-600(塩酸メトキシベラパミル)を含む細胞内溶液(mM)を調製します。CsOHでpHを7.3に調整します。ストック溶液をろ過し、分注し、使用するまで-20°Cで保存します。

2. 解剖

1. 2つのスライスチャンバーを準備し、そのうちの1つに100 mLの解剖液を充填し、もう1つに100 mLの記録溶液を充填します。2つのビーカーを水浴(37°C)に入れ、解剖する前に少なくとも15分間、溶液をカルボゲンで泡立てます。
2. プラスチック製のビーカーに、氷冷に近い(ただし凍結していない)解剖液250mLを入れます。使用の少なくとも15分前にカルボゲンで泡立ててください。
3. 脳の解剖が行われるプラスチック製のペトリ皿(100 mm x 20 mm)に、冷解剖液を入れます。濾紙をペトリ皿の蓋に入れます。
4. ビブラトームの解剖室を冷却します。
5. マウスケージ内などで、2.5%イソフルランでマウスを麻酔します。マウスが尻尾のつまみに反応しない場合はすぐに、頸髄の近くでマウスの首を切り落とし、頭をペトリ皿の底にある氷のように冷たい解剖液に浸します。
6. 頭の皮膚を尾側から鼻側に切り取り、指で横方向に保ち、頭蓋骨を露出させます。前脳を取り出すには、まず頭蓋骨を前後正中線に沿って切断し、次に冠状縫合糸とラムドイド縫合糸をさらに2回切断します(図1A)。
7. 冠状縫合糸とラムドイド縫合糸の間の頭蓋骨を取り外し、大脳が露出するようにします。嗅球を切断し、細い刃で前脳と中脳を分離します(図1B)。細いヘラで頭蓋骨から脳を取り出し、ペトリ皿の蓋の濾紙の上に置きます
   手記：ステップ2.6および2.7は、細胞死を減らすためにできるだけ早く実行する必要があります。
8. 脳スライスのdLGNへの感覚入力と皮質入力の完全性を維持するために、3-5°の角度で傍矢状にカットして2つの半球を分離します(図1C、D)。2つの半球の中間外側面を濾紙の上に置いて乾燥させ、水平面から10〜25°の角度で切断ステージに接着します(図1E)。
9. ステージを金属製のバッファートレイの中央に置き、残りの氷冷解剖液をバッファートレイに静かに注ぎます。強く注ぐと貼り付けられた脳が取り除かれる可能性があるため、この手順は慎重に実行してください(図1F)。
10. バッファートレイを氷で満たされたトレイに置くと、解剖中の温度を低く保つのに役立ちます。250μmのスライスをカミソリの刃で0.1mm/sの速度と1mmの振幅でカットします。
11. スライスを酸素化解剖液で満たされた保持チャンバーに34°Cで約30分間保持し、その後、スライスを34°Cの記録溶液でさらに30分間回復させます。
12. 回収後、スライス保持チャンバーをウォーターバスから取り外し、実験で使用するまでスライスを室温(RT)に保ちます。

3. 電気生理学

1. ホウケイ酸ガラスキャピラリーとフィラメントプーラーを使用してピペットを引っ張ります。記録ピペットの抵抗を3-4MΩに保ちます。同じプロトコルを使用して刺激ピペットを引っ張りますが、引っ張った後に先端を少し壊して直径を大きくします。記録ピペットには細胞内溶液とビオシチンを充填し、刺激ピペットには記録溶液を充填します。
2. スライスを記録チャンバーに入れ、RTで酸素化記録溶液でスライスを連続的に灌流します。
3. 赤外微分干渉コントラスト(IR-DIC)ビデオ顕微鏡を備えた正立顕微鏡でスライスと細胞を視覚化します.
   手記：リレーニューロンは、体細胞のサイズが大きく、一次樹状突起(体細胞から出る枝)が多いため、介在ニューロンと区別されます。介在ニューロンは、より小さな体細胞との双極形態を示します。
4. 刺激ピペットをスライスの上に置いてから、記録ピペットで細胞にパッチを当てます。網膜原性シナプスを調べるには、刺激ピペットを網膜神経節細胞の軸索線維が束ねられている視路に直接置きます(図2A)。皮質形成性シナプスを解析するには、dLGNに吻側に隣接する視床網核に刺激電極を配置します(図2B)。
5. 記録ピペットを記録溶液に浸したら、5 mVの電圧ステップを印加してピペットの抵抗を監視します。保持電位を0mVに設定し、オフセット電位をキャンセルして保持電流が0pAになるようにします。
6. 記録ピペットで細胞に近づき、陽圧を加えます。ピペットが細胞膜に直接接触している場合は、陽圧を放出し、保持電位を-70 mVに設定します。わずかな負圧を加えて、細胞膜がガラスピペットに付着し、ギガオームシールが形成されます(抵抗>1GΩ)。ピペットの静電容量を補正し、負圧パルスを印加してセルを開きます。
7. シナプス機能を調べるには、刺激ピペットを介して0.1 msの電流パルス(約30 μA)を印加します。シナプス反応が観察されない場合は、刺激ピペットを交換する必要があるかもしれません。刺激ピペットを別の位置に置くときは、記録された細胞が失われないように注意してください。
   手記：図2に示す記録例では、視路または皮質形成性線維を30ミリ秒の刺激間間隔で2回刺激することにより、シナプスの短期可塑性を調査しました。ペアパルス比(PPR)は、第2の興奮性シナプス後電流(EPSC)の振幅を第1のEPSC(EPSC2/EPSC1)の振幅で割ることによって計算されました。各刺激プロトコルを20回繰り返した。EPSCの振幅は、20回の掃引の平均電流から測定されました。各繰り返しの時間間隔は、繰り返しによって誘発される短期的な可塑性を避けるために、少なくとも 5 秒でした。
8. 直列抵抗を連続的にモニタするには、5mVの電圧ステップを印加します。解析には、直列抵抗が20MΩ未満のセルのみを使用してください。

結果

図 1: 解剖プロトコルを表すスキーム。(A)マウスの頭蓋骨の水平図、初期カットの位置を示す。最初のカットは矢状縫合糸と一緒に行われ、続いてさらに2つのカットがそれぞれ冠状縫合糸とラムドイド縫合糸と一緒に行われました。破線は切開部を表します。(B)脳全体の矢状図。破線は、大脳が嗅球と中脳から分離されていることを示しています。(C-D)これらのパネルは、2つの半球をそれぞれ水平(C)と冠状(D)のビューから分離するための最初の切断角度を示しています。(E)切断ステージ上の1つの半球のコロナビュー。破線はスライス方向を示します。l、m、d、およびvは、パネルDおよびEの半球の側面をそれぞれ外側、内側、背側、および腹側の側面を表しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
増幅器	HEKA エレクトロニック	EPC 10 USBダブルパッチクランプアンプ
CaCl2	エムシュア	1.02382.1000
塩化コリン	シグマ・アルドリッチ	C1879-1KG
共焦点レーザー走査型顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	TCS SP5
セシCl	エムシュア	1.02038.0100
Cs-グルコン酸	自己準備		市販のCs-グルコン酸がなかったため、自分たちで調製しました
D-600	シグマ・アルドリッチ	M5644-50MG
D-APVの	バイオトレンド	BN0085-100
顕微鏡用デジタルカメラ O	オリンポス	XM10
エグタ	セルヴァ	11290.02
グルコース	シグマ・アルドリッチ	49159から1キロ
ヘープス	ロス	9105.2
大電流刺激アイソレータ	世界の精密機器	A385
KClの	エムシュア	1.04936.1000
MgCl2	エムシュア	1.05833.0250
マイクロマニピュレーター	ルイグス&ノイマン	SM7
ミロスコープ	オリンポス	BX51
封入剤	サーモフィッシャーサイエンティフィック	P36930
NaCl	ロス	3957.1
NaH2PO4	エムシュア	1.06346.1000
NaHCO3	エムシュア	1.06329.1000
ピペット	ヒルゲンベルク	1807502
引き手	サッター	P-1000
カミソリの刃	ペルソナ	〒60-0138
半自動ビブラトーム	ライカバイオシステムズ	VT1200S
SR 95531臭化水素酸塩	バイオトレンド	AOB5680-10	GABAA受容体拮抗薬