ラット脳への無線双方向微小電極システムの移植

Abstract

出典:Melo-Thomas, L., et al., A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats. J. Vis. Exp. (2017年)

このビデオは、無線双方向マルチチャンネル電極ユニットをラットの脳に埋め込んで、マルチチャンネルニューラルネットワークを記録し、刺激する手順を示しています。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 動物

1. ハウスオスの成体Wistarラット(200-250 g)を3〜4匹のグループで、手術前の少なくとも1週間、標準的な実験室条件下で順応させます。
2. 手術の2日後、ハウスラットをペアで。シングルケージを高いアクリル蓋で覆います。インプラントが詰まり、時間の経過とともに損傷したり不安定になったりするリスクが高まる可能性があるため、金属グリッドで作られた従来の蓋は避けてください。

2. 定位手術

1. 手術を始める前に、以下の機器と材料を整理して準備してください。
   1. 滅菌ハサミ、鈍い先端鉗子、へら、手術用バリカン、歯科用ドリル、綿棒からなる滅菌手術器具を入手してください。
   2. イソフルラン、キシロカイン、塩酸トラマドール、デクスパンテノール眼軟膏、3%過酸化水素、ポビドンヨード、70%エタノールなどの薬物や化学物質を入手してください。
   3. ステンレス製ネジ、アクリル樹脂、紫外線接着剤、キャッププロテクターなどの固定材料を入手してください。
   4. (i)記録用単電極(石英ガラス絶縁白金タングステン微小電極、先端形状円錐形、外径:80μm、先端円錐形、インピーダンス1kHz:500kΩ)または四極管(石英ガラス絶縁白金/タングステン4芯微小電極、外径:100μm、円錐先端、インピーダンス1kHz)からなる微小電極ユニットを求めます。 500-800 kOhm);(ii)刺激電極(白金/イリジウム線(白金90%、イリジウム10%)、芯径125μm、外径150μm、インピーダンス<10kΩ)をコンタクトプレートに連結し、(iii)白金線参照電極(軸径100μm;図 1A)。
   5. 水溶性接着剤で微小電極ユニットに接着された電極ホルダーを入手し、少なくとも2時間前に機能をテストします(図1B)。
   6. 差動プリアンプ、メインアンプ、および録音用のバンドパスフィルタアンプで構成される従来のテザーシステムを取得します。
   7. 手袋、加熱パッド、注射器、生理食塩水などの追加の材料を入手します。
   8. 家庭用ケージ(L x W x H:42 cm x 26 cm x 38 cm)を入手します。
2. 手順
   注:電極移植は、イソフルラン麻酔下での従来の定位手術中に行われます。
   1. 実験者が手袋、サージカルマスク、白衣を着用していることを確認してください。
   2. 動物を誘導室(イソフルラン4-5%、酸素流量1 L / min、持続時間~5分)に入れて麻酔を開始します。
   3. 鉗子で反射神経の喪失(尾とつま先の反射)をテストして、深部麻酔を確認します。
   4. 定位フレームの上切歯バーの周りに固定された麻酔マスクに動物の頭を置き、麻酔を調整します(イソフルラン2-3%、酸素流量0.7-0.8L / min)。
   5. 動物の頭部を定位装置に固定し、水平に位置合わせするには、イヤーバーと上切歯バーを使用します。
   6. 手術用バリカンまたはハサミを使用して手術野を剃り、ポビドンヨードで滅菌します。
   7. 低体温症を防ぐために動物を加熱パッドの上に置き、デクスパンテノールの眼軟膏で目を治療して乾燥を防ぎます。
   8. キシロカイン(0.3-0.4 mL、皮下、皮下)を術野の中央に注入します。
   9. 反射神経の喪失を再度テストします。
   10. 手術野の中央にメスで小さな切開(1.5cm)を行い、頭蓋骨を露出させます。皮膚をやさしく分離し、鉗子、はさみ、へらを使用して残留組織を取り除きます。
   11. 過酸化水素でコーティングされた綿棒を使用して頭蓋骨を慎重に清掃します。
   12. ステンレス製のネジを固定するために、頭蓋骨に4〜5個の小さな穴(4.7 mm)を開けます。
   13. 微小電極ユニット/電極ホルダーをプリアンプに接続し、定位マイクロマニピュレータに取り付けます(図1Bおよび1C)。
   14. 使用する動物に応じた脳地図からの座標を使用して、ターゲット領域の上の頭蓋骨に穴(約7 mm)をドリルします。本研究では、ブレグマを基準として、次の座標を使用して下丘に向けられた電極先端を配置します:前部/後部、-8.8 mm;内側/外側、1.5 mm;背側/腹側、3.5mm。
   15. 綿棒で血液を吸収します。
   16. 電極の先端がターゲット領域に到達するまで、微小電極ユニットを垂直に導入します。
   17. アースケーブルをステンレス製のネジに沿って、スキンの下に配置します。
   18. スパイクの活動を監視し、マイクロマニピュレーターで電極の位置を慎重に調整し、ターゲット構造の活動ニューロンのゾーンに到達するまで、スパイクソーティングに適したS/N比で神経活動を検出します。
   19. 微小電極ユニットを紫外線接着剤で頭蓋骨に固定し、コンタクトプレートとネジをアクリル樹脂で覆います。
   20. 生理食塩水(1 mL i.p.)とトラマドール(25 mg / kg、皮下)をそれぞれ注射して、脱水症を防ぎ、術後の鎮痛を確保します。.
   21. 水に浸したブラシを使用して、微小電極ユニットを電極ホルダーから外します。
   22. 麻酔を停止し、ラットを定位フレームから慎重に取り外します。プリアンプを微小電極ユニットから外します。
   23. 埋め込まれた微小電極ユニットのキャップ保護を接続し、実験手順中にのみ取り外します。

Results

図 1: TWS微小電極ユニット。(1)単一電極/四極管の記録、(2)刺激電極、(3)電極ファイバー接続ボード、(4)フレキシブル接続ケーブル、(5)アース線、(6)コネクタボード、(7)TWSシステム用オスまたはメスコネクタ(A);プリアンプ(8)とホルダー(9)に接続されたTWS微小電極ユニット。(B)脳定位固定装置フレーム(C)に取り付ける準備ができています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thomas Wireless System (TWS) バージョン 2.0	トーマス・レコーディングGmbH	AN001165	Thomas Wireless System(TWS)バージョン2.0は、ラップトップコンピュータ、プリインストールされたMicrosoft Windowsオペレーティングシステム、およびTWS制御ソフトウェアを備えたポータブルマルチチャネルテレメトリシステムです。TWSには、低ノイズの4チャンネルプリおよびプログラマブルメインアンプ、固定帯域幅、二相性電流パルスのアプリケーション用のシングルチャンネル定電流刺激装置、ソフトウェアプログラマブルマイクロ刺激装置、埋め込み型コネクタシステム、動物に取り付けるための基本的なヘッドステージユニットが含まれています。このシステムには、ラップトップまたはデスクトップパーソナルコンピュータ用のUSBポート接続を備えたトランシーバー、MicrosoftオペレーティングシステムWindowsで動作する制御ソフトウェアが付属しています。TWSシステムは、自由に行動する小動物(ラット、モルモットなど)の細胞外神経刺激および記録に使用できます。このシステムは、より大きな動物(霊長類など)にも使用できるように適合させることができます。
Thomas Wireless System(TWS)用ソフトウェア	トーマス・レコーディングGmbH	に含まれるもの AN001165	Thomasワイヤレスシステム用のソフトウェアは、Microsoft Windowsオペレーティングシステムで実行され、Thomas Wireless System(TWS)のグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)を提供します。TWS GUIは、TWS機能の完全な制御を提供します:4チャンネル録音と1チャンネル刺激。
記録用(4チャンネル)および刺激用(シングルチャンネル)用の埋め込み型四極管	トーマス・レコーディングGmbH	AN001132	Thomas Wireless Systems(TWS)で使用するための記録(4チャンネル)および刺激(シングルチャンネル)用の埋め込み型四極管. 四極管の仕様の記録:四極管繊維材料:石英ガラス絶縁プラチナタングステン繊維、四極管繊維外径:100μm、先端形状D、インピーダンス0.5-0.8MOHm;基準電極:先端形状:D;インピーダンス:300-500kOhm;材質:石英ガラス絶縁プラチナ/タングステン;刺激電極仕様:繊維材質:白金/イリジウム、直径:125μm、漆絶縁、先端形状:D、インピーダンス:<10kΩ、電極の寸法はエンドユーザーが指定可能
記録用(シングルチャンネル)および刺激用(シングルチャンネル)用の埋め込み型微小電極	トーマス・レコーディングGmbH	AN001118	Thomas Wireless Systems(TWS)で使用するための記録(シングルチャネル)および刺激(シングルチャネル)用の埋め込み型微小電極. 記録電極仕様:電極繊維材質:石英ガラス絶縁プラチナタングステン繊維、電極繊維外径:80μm / 250μm(指定してください)、先端形状D、インピーダンス0.5-0.8MOHm;基準電極:先端形状:D;インピーダンス。300-500kΩ;材質:石英ガラス絶縁プラチナ/タングステン;刺激電極仕様:繊維材質:白金/イリジウム、直径:125μm、漆絶縁、先端形状:D、インピーダンス:<10kOhm
電極注入用ホルダー	トーマス・レコーディングGmbH	AN000838	標準的な電極ホルダー用の微小電極注入用の特殊な曲げ金属棒。ロッドは、埋め込み型電極を保持するために使用されます。埋め込み型電極は、特殊なThomas RECORDING水溶性接着剤(AN001080)でロッドに固定されています。(電極ホルダーは付属しません)
Thomas Wireless System(3,7V / 230mAh)の交換用アキュムレータ電源	トーマス・レコーディングGmbH	AN001208	トーマスワイヤレスシステム用の交換用充電式バッテリー(アキュムレータ)で、容量は230mAで、動作時間は約1時間です。(サイズ:27mm×20mm×6mm、重量約6g)
Thomas Wireless System(3,7V / 450mAh)の交換用アキュムレータ電源	トーマス・レコーディングGmbH	AN001209	トーマスワイヤレスシステム用の交換用充電式バッテリー(アキュムレータ)で、容量は450mAで1時間以上の動作が可能です。(サイズ:48mm x 30mm x 4mm、重量約11g)
Thomas Wireless System(TWS)充電式アキュムレータ用アキュムレータ充電器	トーマス・レコーディングGmbH	AN001207	Thomas Wirless System(TWS)充電式アキュムレータ(AN001209およびAN001209)用の主電源充電器
水溶性接着剤	トーマス・レコーディングGmbH	AN001080	Thomas RECORDINGの水溶性電極接着剤は、神経科学研究において埋め込み型微小電極と組み合わせて使用するために特別に選ばれた製品です。そのユニークな特性により、電極と取り付け装置の間の強固な接続が保証されますが、温水で簡単に取り外すことができます。Thomas RECORDINGの水溶性電極接着剤は、箱から出してすぐに使用でき、時間のかかる準備は必要ありません。Thomas RECORDINGの水溶性電極接着剤は、人間、動物、環境に害を及ぼすことはありません。数量:10グラムの1箱
ミニチュア差動プリアンプ	トーマス・レコーディングGmbH	AN000329	ミニチュア差動プリアンプ、モデルMDPA-2は、興奮性組織からの低ノイズ記録用に設計された2チャンネルの差動入力プリアンプです。これは、Thomas Wireless System(TWS)を使用して自由に動く動物アプリケーション用の埋め込み型微小電極の埋め込みと組み合わせた細胞外記録を目的としています。2チャンネルミニチュア差動プリアンプ(MDPA-2)は、最初の10倍増幅ステージを提供するために、埋め込み型微小電極に接続されています。理想的には、Thomas RECORDINGの石英ガラス絶縁プラチナ/タングステン電極を使用して、高い信号振幅と低いノイズレベルで最適な録音結果が得られます。MDPA-2には、追加のコモングランドおよび参照電極入力があります。
接続ケーブル	トーマス・レコーディングGmbH	AN000330	Thomas Miniature差動プリアンプ(MDPA-2)をメインに接続するための接続ケーブル amplifierとアキュムレータ電源。
ミニチュアプリアンプ用充電式電源	トーマス・レコーディングGmbH	AN000328	ミニチュア差動プリアンプ(MDPA-2)用の充電式アキュムレータ電源。
アキュムレータ充電器(米国)	トーマス・レコーディングGmbH	AN000167	電源用アキュムレータ充電器 AN000328 (米国主電源コンセントコネクタ)
アキュムレータ充電器(EU)	トーマス・レコーディングGmbH	AN000168	電源AN000328用アキュムレータ充電器(EU主電源コンセントコネクタ)
差動プリアンプ/メインアンプ/バンドパスフィルタ	トーマス・レコーディングGmbH	AN000677	TREC ACメインアンプ(LabAmp-03)は、神経生理学的アプリケーション(微小電極による細胞外記録など)向けのシングルチャネル差動メインアンプです。この装置は、ミニチュア差動プリアンプ、モデルMDPA-2で動作するように設計されています。LabAmp-03のシングルチャンネルには、高ゲイン、低ノイズの差動アンプステージと、それに続く低周波および高周波フィルタが含まれています。アンプには、シングルユニットアクティビティ(SUA)フィルタアンプとローカル電界電位(LFP)フィルタアンプの2つの異なるフィルタアンプがあり、どちらも信号パスで並列に接続されています。録音モードでは、最初のステージに2つのレベルの信号ゲイン(x10、x100)、最終アンプステージに4つの追加レベル(x5、x10、x25、x50)を提供します。各アンプは、シングルユニットアクティビティ(SUA)500Hz〜20kHzとローカルフィールドポテンシャル(LFP)0,1Hz〜140Hzに対して異なるバンドパス特性を持っています。オーディオモニターとウィンドウ識別器がデバイスに統合されています。LabAmp-03には、スピーカー付きのオーディオモニターが内蔵されています。このユニットは、電気生理学的信号のオーディオ再生を提供します。このユニットは、オーディオアンプをコンパクトで頑丈なパッケージに組み合わせています。これは、神経発火と筋肉の収縮を監視するのに特に適しています。オーディオモニタ入力は、SUA-Filterアンプ出力に内部接続されています。LabAmp-03は、100-240V AC/50-60Hzの主電源動作電圧範囲の外部電源が付属しています。
USBオシロスコープ	トーマス・レコーディングGmbH	AN001096	USB PC Oszilloskop、2 Kanal。この2チャンネルPCオシロスコープは、ラップトップでのモバイル使用や、制御キャビネット、産業機器、および小型で軽量で強力なオシロスコープが必要な他の多くのアプリケーションに恒久的に設置するのに最適です。このオシロスコープは、メインアンプの信号出力に接続されており、トーマスワイヤレスシステム(TWS)の埋め込み型微小電極の説明中に記録された細胞外活動を表示するためのものです。ユーザーは、付属のPCソフトウェアを使用して、PC上のいくつかのデータインターフェースを介して直接測定データを取得できます。
刺激発生器	マルチチャネルシステム	STG3008-FA	電流用スティミュラスジェネレーター(STG)と電圧駆動スティミュレーションは、電流駆動刺激、電圧駆動刺激、制御、タイミングの3つの機能を果たします。STGは、2、4、または8つの独立した出力チャンネルで利用できます。STGは、各出力チャンネルにアイソレーションユニットを内蔵しているため、任意の波形を提供できます。
電極用キャッププロテクター	トーマス・レコーディングGmbH	AN001193	Thomas Wireless Systemの埋め込み型電極ユニット用保護キャップ
手術用機器			ハサミ、鈍器鉗子、ヘラ、手術用バリカン、歯科用ドリル、綿棒
医薬品および化学薬品			イソフルラン、キシロカイン、塩酸トラマドール(Tramadol-CT、AbZ-Pharma GmbH、ウルム、ドイツ)、デクスパンテノール眼軟膏(Bepanthen、Bayer AG、レバークーゼン、ドイツ)、3%過酸化水素、ポビドン-ヨウ素(Betaisodona、Mundipharma GmbH、リンブルフ、ドイツ)および70%エタノール;
固定材料を含むもの			ステンレス鋼ネジ(BN650 M1.2x5、4.7 mm)、アクリル樹脂(Paladur、Heraeus Holding GmbH、ハーナウ、ドイツ)、紫外線接着剤(Cyberbond U3300、Cyberbond Europe GmbH、ドイツ)、キャッププロテクター(Thomas Recording GmbH、ギーセン、ドイツ)。
追加資料			手袋、温熱パッド、注射器、生理食塩水。
小動物定位固定装置(SASI)	トーマス・レコーディングGmbH	AN000287	モデルは、研究で使用された動物(ラット、モルモット、サルなど)に応じて選択する必要があります
ビデオカメラ	エバーフォーカス		EverFocus、モデル:EQ150