マウス海馬切片におけるニューロンの光刺激および全細胞パッチクランプ記録

要約

出典:Richevaux, L., et al.マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のためのin vivo脳定位注射。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオは、トランスフェクションされたマウス海馬の脳スライスにおけるシナプス相互作用とニューロン応答を研究するためのプロトコルを示しています。これには、長距離の感覚ニューロンを照射して活動電位をトリガーし、全細胞パッチクランプ技術を使用して記録されたニューロンに結果として生じる興奮性シナプス後電位を記録することが含まれます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

>1. 急性スライス記録のソリューション

1. 電気生理学実験の前に、10x 人工脳脊髄液 (aCSF) 溶液 (124 mM NaCl、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO₃、1 mM NaH₂PO₄、および 11 mM D-グルコース) のストック溶液を純脱イオン水で調製します。溶液をCaCl₂およびMgCl₂を含まない1 Lボトルに4°Cで保存します。
2. 135 mM K-グルコン酸、1.2 mM KCl、10 mM HEPES、0.2 mM EGTA、2 mM MgCl₂、4 mM MgATP、0.4 mM Tris-GTP、10 mM Na₂-ホスホクレアチン、および2.7–7.1 mMバイオシチンを含むグルコン酸カリウムベースのピペット溶液を調製して、ポストホック細胞形態の解明を行います。溶液のpHを7.3に、浸透圧を290 mOsmに調整します。1 mLのアリコートを-20°Cで保存します。

2. 全細胞パッチクランプ記録

1. 海馬複合体を含む脳スライスをカスタムメイドのガラス製トランスファーピペットで、直立顕微鏡に取り付けられた記録チャンバーに静かに移します。トランスファーピペットは、ゴム製のピペットバルブに取り付けられたパスツールピペット(内径6.5mm)を短くしたものです。95%/5% O₂/CO₂ で泡立った 34 °C (加温) aCSF で記録チャンバー (3 mL) を連続的に灌流します。蠕動ポンプの速度を2〜3mL / minに設定します。
2. 青色LED照明(470 nm)を用いて、目的領域の軸索終末におけるChronos-GFPの発現を簡単に調べ、4倍対物レンズで観察します。GFP蛍光は、適切な発光フィルターを通じて可視化され、CCDカメラの画像がコンピューター画面に表示されます。
3. U字型のプラチナワイヤーで作られたスライスアンカーをスライスにしっかりと間隔を空けたナイロン弦(「ハープ」)を配置して、スライスを維持します。
4. 63倍のイマージョン対物レンズに変更し、ピントを調整します。Chronos-GFPを発現する軸索を確認し、パッチ記録用の錐体ニューロンを選択します。
5. 目標を上に移動します。
6. ホウケイ酸ガラスのBrown-Flaming電極プーラーを使用してピペットを引っ張ります。プーラーは、先端径が約1μmのピペットを製造するように設定されています。ピペットにK-グルコン酸ベースの内部溶液を充填します。
7. ピペットをヘッドステージのピペットホルダーに取り付けます。チャンバー内のピペットを下げ、対物レンズの下の先端を見つけます。ピペット抵抗は3〜8MΩである必要があります。シリンジで軽い陽圧を加えて、ピペットから溶液が流出する円錐形を確認し、ピペットと対物レンズをスライスの表面まで徐々に下げます。
8. 電圧クランプ構成で細胞にパッチを当てます:識別されたニューロンに近づき、ピペットの先端を体細胞に繊細に押し付けます。正圧により、膜表面にくぼみができるはずです。圧力を解放してギガオームシール(>1GΩ抵抗)を作成します。密閉したら、保持電圧を-65mVに設定します。負圧の鋭いパルスでメンブレンを壊します:これは、ピペットホルダーに接続されたチューブに強力な吸引を加えることによって達成されます。
9. 全細胞電流クランプモードで、過分極および脱分極電流ステップに対するニューロンの応答を記録します(図1A).
   手記：このプロトコルは、細胞の能動的および受動的な内因性特性を決定するために使用されます。カスタム記述の MATLAB ルーチンは、オフライン解析に使用されます。
10. Chronosを発現する求心性線維の全視野475nm LED刺激に対する電流クランプまたは電圧クランプシナプス後応答を記録します。20 Hz で 2 ms 持続時間の 10 回の刺激の列で刺激します (図 1 B、C)。光強度は0.1〜2mW.
    の範囲で変化します 手記：光強度は、フォトダイオードセンサーを搭載したデジタルハンドヘルド光学パワーコンソールで対物レンズの下に配置して測定しました。2〜4ミリ秒の応答遅延は、単シナプス結合に特徴的です。

結果

図1:脳下前層IIIニューロン:固有の特性、視床求心性の光刺激に対する応答、および細胞形態の事後的解明。(A)過分極および脱分極電流ステップのためのIII層ニューロンの発火パターンと膜電位の変化。(B、C)(B)電流クランプモードおよび(C)電圧クランプモードで記録された視床軸索の2 ms光刺激(青いバー)に対する第III層ニューロンの応答。(D、E)落射蛍光顕微鏡(D、スケールバー=100μm)および共焦点顕微鏡(E、スケールバー=50μm)でイメージングした水平スライスにDAPI染色(青)を施した眼瞼下前表層にChronos-GFP(緑)を発現する視床軸索に...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
KClの	シグマ	P4504	最終 1.2 mM
塩化マグネシウム	シグマ	63069	最終的な 2 mM
マルチクランプ 700B	Axon インスツルメンツ
pClamp アクイジションソフトウェア	Axon インスツルメンツ
蠕動ポンプ	ギルソン	ミニパルス3	ディスプレイ上の14-16 2-3 ml /分
グルコン酸カリウム(K-グルコン酸)	シグマ	G4500	最終 135 mM
ホウケイ酸毛細血管	ハーバード装置	GC150-10	外径1.5mm、内径0.86mm
ブラウンフレーミング電極プーラー	サッターインストゥルメント	P-87
エグタ	シグマ	E4368	最終 0.2 mM
470 nm LED	ケアンリサーチ	P1105/470/LED DC/59022メートル	マッチング励起フィルター470/40xおよびGFP用蛍光フィルターと併用
AAV5です。Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH	ペンベクトルコア	AV-5-PV3446	ロットV6026R、qTiter GC / ml 4.912e12、ddTiter GC / ml 2.456e13
CCDカメラ	アンドール	DL-604メートル
共焦点顕微鏡	ツァイス	LSM710	20倍
デジデータ 1440A	Axon インスツルメンツ
デジタルハンドヘルド光学メーター	トールラボ	PM100Dの	475 nmでパラメータ設定
ヘープス	シグマ	H3375-J	ファイナル 10 mM
LED電源	ケアンリサーチ	OptoLED光源