脳切片中の神経細胞の光学的および電気生理学的同時モニタリング

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

>1. マルチチャンネル録音用のハードウェアとソフトウェアの準備

1. メーカーの指示に従って16チャンネルのデータ収集システムをセットアップします。
   手記：いくつかの市販のアンプとデータ収集システムを使用して、マルチチャンネル録音を収集できます。ここで説明する実験では、アナログ信号は電極リファレンスパネルを介して2つのアンプに供給され、そこで増幅(2000倍)およびフィルタリング(0.1〜10kHz)されます。データ・アクイジション・システムへのアナログ入力は、40kHzでデジタル化されます。
2. 適切な16チャンネルヘッドステージアダプターを顕微鏡マイクロマニピュレーターに固定します。アダプタの向きは、メスコネクタポートが下を向くようにします。
3. このマイクロマニピュレータの動作角度を調整して、水平に対して約70°の角度で記録チャンバに向かって下向きになるようにします。
4. マイクロマニピュレーターに固定されたヘッドステージアダプターを介して、ヘッドステージ入力をin vitro電気生理学用の16 x 1プローブに接続します。
5. ヘッドステージ出力コネクタをデータ収集システムに接続します。
6. データ集録に適したソフトウェアをインストールします。最初の15個のマルチチャンネルプローブ接点からの入力信号に対応するように、15個の入力チャンネルを構成します。残りのチャネルを細胞内電極から入力を受信するように構成します.
   手記：データを収集および解析するときは、電極とアダプターのマップを考慮して、適切な信号が収集された電極の接点に対応していることを確認してください。

2. 光刺激プロトコルの設定

1. ライトデリバリーシステムをセットアップし、付属のソフトウェアをインストールします。
2. ソフトウェアを起動します。トリガーソース(デジタル/TTL(トランジスタ-トランジスタロジック)出力)がトリガー入力信号を光供給システムに供給し、光供給システムが470nm LED(発光ダイオード)にトリガー出力信号を提供するハードウェア配線構成を選択します。
3. 高倍率対物レンズを搭載。デジタルカメラを使用して、光供給システムで高出力対物レンズを校正します。
4. 光刺激プロファイルの新しいプロファイルシーケンスを作成します。
   1. 選択パターンを作成します。ここで説明する実験では、直径150μmの円により、軸索終末の層特異的な活性化が可能になります。
   2. プロファイル シーケンスを作成するには、任意の回数の試行ごとにこのプロファイルをコピーして貼り付けます。
   3. 任意の光強度、パルス幅、またはパルス数の波形を含む波形リストを作成します。
   4. 各プロファイルに波形をランダムに割り当てます。各プロファイルとそれに割り当てられた波形は、デジタルTTL入力からの1つのトリガパルスまたは1つの試行に対応します。
   5. プロファイル順序を保存します。
5. データ集録ソフトウェアで、新しいプロトコルを作成します。
   1. 試行回数を、作成したプロファイル シーケンスのプロファイル数と等しくなるように設定します。
   2. ステップ1.6で設定した信号入力と一致する信号入力を選択します。1つのデジタルTTL出力を提供するプロトコルを構成し、デジタルトリガーの前後でこれらの16の入力チャンネルから適切な時間録音します。

3. ex vivo脳組織切片へのマルチチャンネルプローブの配置

1. 灌流は、eACSF(実験的人工脳脊髄液)(密封された袋に入っていない)を3〜6mL / minで泡立てました。
2. 関心領域を含む脳スライスを顕微鏡灌流チャンバーのメッシュグリッドに移します。プラチナハープのアンカー
3. マルチチャネルプローブの遠位端の電極接触線がピアル表面に対してほぼ垂直になるようにメッシュグリッドを回転させます。
4. マルチチャンネルプローブをスライスの表面に向かって下げ、広視野照明とマイクロマニピュレータの微調整下
で行います。
5. フィルターキューブタレットを回転させて適切なフィルターキューブにかみ合わせ、皮質求心性の軸索終末に発現する蛍光レポータータンパク質を視覚化します。必要に応じて、スライスを回転させて、プローブをピアル表面により正確に位置合わせします。
6. プローブをスライスの平面のすぐ上、x軸に沿った最終ターゲット位置から~200 μm手前に配置し、記録する組織領域の境界の外側に少なくとも1つのチャネルを残します。
7. マニピュレーターをその長手方向軸に沿って動かして、プローブをスライスにゆっくりと挿入します。組織への損傷を最小限に抑えるには、鋭い先端が組織表面の下に見える程度までのみプローブを進めます。これにより、組織への損傷を最小限に抑えながら、電極の接触が組織に接触していることを確認できます。

4. 標的ニューロンのパッチクランプと全細胞構成の取得

1. eACSFソースを袋詰めされた制御ソリューションに切り替えます。
2. ターゲットパッチクランプ記録のための蛍光標識細胞を同定します。
   1. 絞り絞りを最小直径に制限します。低倍率の対物レンズを装着し、組織にピントを合わせます。
   2. マルチチャンネルプローブに隣接する(ただし重なっていない)組織の領域に光を集中させます。
   3. 高倍率(40倍または60倍)の水浸対物レンズにかみ合わせ、マルチチャンネルプローブと対物レンズが接触しないように注意して使用します。
   4. フィルターキューブタレットを回転させて適切なフィルターセットにかみ合わせると、Cre依存性蛍光マーカーを発現する細胞のイメージングが可能になります。
   5. 蛍光標識された細胞をパッチクランプ記録のターゲットとして同定します。対物レンズを上げると、パッチピペットを下げるための十分なスペースが確保されます。
3. パッチピペット(表1を参照)に内部溶液(表2)をセットし、ピペットを電極ホルダーに取り付けます。1mLシリンジを使用して、~0.1mLの空気に相当する陽圧を加えます。
4. パッチピペットを溶液に下げます。目視でピペットチップにピントを合わせます。
5. 以前に示したステップを使用して、標的細胞から全細胞記録を取得する33。
6. 細胞の固有特性(入力抵抗、現在のステップに応じた活動電位発火率など)の変化を評価する予定の場合は、これらの記録を実施してください。それ以外の場合は、以下の軸索刺激プロトコルに進んでください。

>表1:人工脳脊髄液と細胞内溶液の組成。eACSFの試薬と濃度、およびパッチクランプ記録用の細胞内ピペット溶液がリストされています。