脳切片中の神経細胞の光学的および電気生理学的同時モニタリング

要約

出典:Murphy, C. A., et al. Optogenetic activation of neuroferent pathways in brain slices and modulation of responses by volatile anesthetics. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、ニューロン特異的な蛍光タンパク質を含むトランスジェニック脳切片の電気的活動を同時にイメージングし、記録する方法を概説しています。この手順では、脳スライスを曝気された人工脳脊髄液で灌流チャンバーに保持し、光源を使用して蛍光標識細胞を励起し、マルチチャネルプローブとパッチクランプで電気信号を記録する。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

>1. マルチチャンネル録音用のハードウェアとソフトウェアの準備

1. メーカーの指示に従って16チャンネルのデータ収集システムをセットアップします。
   手記：いくつかの市販のアンプとデータ収集システムを使用して、マルチチャンネル録音を収集できます。ここで説明する実験では、アナログ信号は電極リファレンスパネルを介して2つのアンプに供給され、そこで増幅(2000倍)およびフィルタリング(0.1〜10kHz)されます。データ・アクイジション・システムへのアナログ入力は、40kHzでデジタル化されます。
2. 適切な16チャンネルヘッドステージアダプターを顕微鏡マイクロマニピュレーターに固定します。アダプタの向きは、メスコネクタポートが下を向くようにします。
3. このマイクロマニピュレータの動作角度を調整して、水平に対して約70°の角度で記録チャンバに向かって下向きになるようにします。
4. マイクロマニピュレーターに固定されたヘッドステージアダプターを介して、ヘッドステージ入力をin vitro電気生理学用の16 x 1プローブに接続します。
5. ヘッドステージ出力コネクタをデータ収集システムに接続します。
6. データ集録に適したソフトウェアをインストールします。最初の15個のマルチチャンネルプローブ接点からの入力信号に対応するように、15個の入力チャンネルを構成します。残りのチャネルを細胞内電極から入力を受信するように構成します.
   手記：データを収集および解析するときは、電極とアダプターのマップを考慮して、適切な信号が収集された電極の接点に対応していることを確認してください。

2. 光刺激プロトコルの設定

1. ライトデリバリーシステムをセットアップし、付属のソフトウェアをインストールします。
2. ソフトウェアを起動します。トリガーソース(デジタル/TTL(トランジスタ-トランジスタロジック)出力)がトリガー入力信号を光供給システムに供給し、光供給システムが470nm LED(発光ダイオード)にトリガー出力信号を提供するハードウェア配線構成を選択します。
3. 高倍率対物レンズを搭載。デジタルカメラを使用して、光供給システムで高出力対物レンズを校正します。
4. 光刺激プロファイルの新しいプロファイルシーケンスを作成します。
   1. 選択パターンを作成します。ここで説明する実験では、直径150μmの円により、軸索終末の層特異的な活性化が可能になります。
   2. プロファイル シーケンスを作成するには、任意の回数の試行ごとにこのプロファイルをコピーして貼り付けます。
   3. 任意の光強度、パルス幅、またはパルス数の波形を含む波形リストを作成します。
   4. 各プロファイルに波形をランダムに割り当てます。各プロファイルとそれに割り当てられた波形は、デジタルTTL入力からの1つのトリガパルスまたは1つの試行に対応します。
   5. プロファイル順序を保存します。
5. データ集録ソフトウェアで、新しいプロトコルを作成します。
   1. 試行回数を、作成したプロファイル シーケンスのプロファイル数と等しくなるように設定します。
   2. ステップ1.6で設定した信号入力と一致する信号入力を選択します。1つのデジタルTTL出力を提供するプロトコルを構成し、デジタルトリガーの前後でこれらの16の入力チャンネルから適切な時間録音します。

3. ex vivo脳組織切片へのマルチチャンネルプローブの配置

1. 灌流は、eACSF(実験的人工脳脊髄液)(密封された袋に入っていない)を3〜6mL / minで泡立てました。
2. 関心領域を含む脳スライスを顕微鏡灌流チャンバーのメッシュグリッドに移します。プラチナハープのアンカー
3. マルチチャネルプローブの遠位端の電極接触線がピアル表面に対してほぼ垂直になるようにメッシュグリッドを回転させます。
4. マルチチャンネルプローブをスライスの表面に向かって下げ、広視野照明とマイクロマニピュレータの微調整下
で行います。
5. フィルターキューブタレットを回転させて適切なフィルターキューブにかみ合わせ、皮質求心性の軸索終末に発現する蛍光レポータータンパク質を視覚化します。必要に応じて、スライスを回転させて、プローブをピアル表面により正確に位置合わせします。
6. プローブをスライスの平面のすぐ上、x軸に沿った最終ターゲット位置から~200 μm手前に配置し、記録する組織領域の境界の外側に少なくとも1つのチャネルを残します。
7. マニピュレーターをその長手方向軸に沿って動かして、プローブをスライスにゆっくりと挿入します。組織への損傷を最小限に抑えるには、鋭い先端が組織表面の下に見える程度までのみプローブを進めます。これにより、組織への損傷を最小限に抑えながら、電極の接触が組織に接触していることを確認できます。

4. 標的ニューロンのパッチクランプと全細胞構成の取得

1. eACSFソースを袋詰めされた制御ソリューションに切り替えます。
2. ターゲットパッチクランプ記録のための蛍光標識細胞を同定します。
   1. 絞り絞りを最小直径に制限します。低倍率の対物レンズを装着し、組織にピントを合わせます。
   2. マルチチャンネルプローブに隣接する(ただし重なっていない)組織の領域に光を集中させます。
   3. 高倍率(40倍または60倍)の水浸対物レンズにかみ合わせ、マルチチャンネルプローブと対物レンズが接触しないように注意して使用します。
   4. フィルターキューブタレットを回転させて適切なフィルターセットにかみ合わせると、Cre依存性蛍光マーカーを発現する細胞のイメージングが可能になります。
   5. 蛍光標識された細胞をパッチクランプ記録のターゲットとして同定します。対物レンズを上げると、パッチピペットを下げるための十分なスペースが確保されます。
3. パッチピペット(表1を参照)に内部溶液(表2)をセットし、ピペットを電極ホルダーに取り付けます。1mLシリンジを使用して、~0.1mLの空気に相当する陽圧を加えます。
4. パッチピペットを溶液に下げます。目視でピペットチップにピントを合わせます。
5. 以前に示したステップを使用して、標的細胞から全細胞記録を取得する33。
6. 細胞の固有特性(入力抵抗、現在のステップに応じた活動電位発火率など)の変化を評価する予定の場合は、これらの記録を実施してください。それ以外の場合は、以下の軸索刺激プロトコルに進んでください。

>表1:人工脳脊髄液と細胞内溶液の組成。eACSFの試薬と濃度、およびパッチクランプ記録用の細胞内ピペット溶液がリストされています。

の 名 名 名 名 名 の 名 名

	実験 ACSF、eACSF (単位: mM)
NaCl	111
NaHCO3	35
ヘープス	20
KClの	1.8
CaCl2	2.1
MgSO4	1.4
KH2PO4	1.2
グルコース	10
	内部ソリューション
K-グルコン酸	140
NaCl	10
ヘープス	10
エグタ	0.1
MgATPの	4
NaGTPの	0.3
	pH = 7.2

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2.5倍広視野対物レンズ	オリンポス	MPLFLN2.5倍
40倍水浸対物レンズ	オリンポス	LUMPLFLN40XW
95%O2/5%CO2混合物	エアガス	Z02OX95R2003045
A16プローブ	ニューロネクサス	A16x1-2ミリメートル-100-177-A16	16チャンネルプローブ
麻酔ガスモニター(POET II)	批評家	602-3A
塩化カルシウム(CaCl2)	ドットサイエンティフィック	DSC20010	ACSFの
キャピラリーガラス(パッチクランプ録音)	キングプレシジョングラス株式会社	KG-33	ホウケイ酸、内径:1.1mm、外径:1.7mm、長さ:90.0mm
キャピラリーガラス(ウイルス注射)	ドラモンド・サイエンティフィック・カンパニー	3-000-203-G/X	3.5インチ
ジュニアマイクロマニピュレーターの制御	ルイグスとノイマン	SM8	ジュニアマイクロマニピュレーターの制御用
マニピュレーターとシフトテーブルの制御	ルイグスとノイマン	SM7	マルチチャンネル電極とシフトテーブルの制御用
デジデータ 1440A + クランペックス 10	分子デバイス	1440A	デジタイザとソフトウェア
E-3603チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14171208	95% O2/5% CO2 ガス混合物のインキュベーションチャンバーへの送達 + パッチクランプ時の圧力適用
エグタ	ドットサイエンティフィック	DSE57060	細胞内溶液
ERP-27 EEGリファレンス/パッチパネル	神経リンクス	引退
充填針	世界の精密機器	50821912	充填パッチクランプピペット用
イメージング用フィルターキューブ EYFP	オリンポス	U-MRFPHQの
濾紙	フィッシャーサイエンティフィック	09801E	ティッシュブロックの調製中にスライステンプレートを覆う
フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー	サッターインストゥルメント	P-1000	2.5x2.5ボックスフィラメント
ガス分散チューブ	シグマ・アルドリッチ	CLS3953312C
ガラスシリンジ(100mL)	シグマ・アルドリッチ	Z314390	ガスシール袋の充填用
グルコン酸、カリウム塩(K-グルコン酸)	ドットサイエンティフィック	DSG37020	細胞内溶液
グルコース	ドットサイエンティフィック	DSG32040	ACSFの
GTP、ナトリウム塩	シグマ・アルドリッチ	G8877	細胞内溶液
ヘッドステージプローブアダプター	ニューロネクサス	A16-OM16	16チャンネルプローブをヘッドステージ入力に接続するためのアダプター
ヘープス	ドットサイエンティフィック	DSH75030	ACSF、細胞内溶液
HS-16ヘッドステージ	神経リンクス	引退
イソフルラン	パターソン獣医	07-893-1389
イソプロピルアルコール(70%)	VWRインターナショナル	101223から746
ジュニアマイクロマニピュレーター	ルイグスとノイマン	210-100 000 0090-R	パッチクランプ電極の操作用
LED光源制御モジュール	マイテックス	BLS-PL02_US	光遺伝学的光源制御
Lynx-8アンプ	神経リンクス	引退
Lynx-8電源	神経リンクス	引退
硫酸マグネシウム(MgSO4)	ドットサイエンティフィック	DSM24300	ACSFの
mCherry, Texas レッドフィルターキューブ	彩度	49008	画像診断用 TDTomato 蛍光レポーター
メロキシカム
マイクロピペットホルダー	フィッシャーサイエンティフィック	NC9044962
マイクロシリンジポンプ	世界の精密機器	UMP3-4
マルチクランプ 700A	分子デバイス/軸索機器	700エー	増幅器
窒素(エアテーブル用)	エアガス	NI200
ナイロンメッシュ	フィッシャーサイエンティフィック	501460083	平らにされたプラチナワイヤーの馬蹄形に引き伸ばされ、録音中はこの上にスライスレスト
ナイロン、パンストからカット	ジェネリックブランド		インキュベーションチャンバーでスライスプラットフォームを作成するための小片、プラチナハープを作成するための単一繊維
ピペット	ドットサイエンティフィック	307	ティッシュをリグに転送するため
プラチナ線	VWRインターナショナル	BT124000	2 cm、平らに、プラチナハープを作るために
ポリゴン400	マイテックス	DSI-E-0470-0617-000	光遺伝学的光送達システム、PolyScan2ソフトウェアが付属
塩化カリウム(KCl)	ドットサイエンティフィック	DSP41000	ACSFの
リン酸カリウム(KH2PO4)	ドットサイエンティフィック	DSP41200	ACSFの
密封されたガスバッグ	フィッシャーサイエンティフィック	109236
顕微鏡用シフトテーブル	ルイグスとノイマン	380FMUの
重炭酸ナトリウム(HCO3-)	ドットサイエンティフィック	DSS22060	ACSFの
塩化ナトリウム(NaCl)	ドットサイエンティフィック	DSS23020	ACSF、細胞内溶液
シリンジ(1 mL)、LuerLockチップ付き	フィッシャーサイエンティフィック	309628	パッチクランプ時の圧力適用用
スリップチップ付きシリンジ(1mL)	WWグレインジャー株式会社	19G384	充填パッチクランプピペット用
シリンジフィルター	VWRインターナショナル	66064-414
正立顕微鏡	オリンポス	BX51
Wypall タオル	フィッシャーサイエンティフィック	19-042-427

の の (代表) を置きます 名 の