脳切片中の神経細胞の光学的および電気生理学的同時モニタリング

要約

出典:Murphy, C. A., et al. Optogenetic activation of neuroferent pathways in brain slices and modulation of responses by volatile anesthetics. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、ニューロン特異的な蛍光タンパク質を含むトランスジェニック脳切片の電気的活動を同時にイメージングし、記録する方法を概説しています。この手順では、脳スライスを曝気された人工脳脊髄液で灌流チャンバーに保持し、光源を使用して蛍光標識細胞を励起し、マルチチャネルプローブとパッチクランプで電気信号を記録する。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

>1. マルチチャンネル録音用のハードウェアとソフトウェアの準備

1. メーカーの指示に従って16チャンネルのデータ収集システムをセットアップします。
   手記：いくつかの市販のアンプとデータ収集システムを使用して、マルチチャンネル録音を収集できます。ここで説明する実験では、アナログ信号は電極リファレンスパネルを介して2つのアンプに供給され、そこで増幅(2000倍)およびフィルタリング(0.1〜10kHz)されます。データ・アクイジション・システムへのアナログ入力は、40kHzでデジタル化されます。
2. 適切な16チャンネルヘッドステージアダプターを顕微鏡マイクロマニピュレーターに固定します。アダプタの向きは、メスコネクタポートが下を向くようにします。
3. このマイクロマニピュレータの動作角度を調整して、水平に対して約70°の角度で記録チャンバに向かって下向きになるようにします。
4. マイクロマニピュレーターに固定されたヘッドステージアダプターを介して、ヘッドステージ入力をin vitro電気生理学用の16 x 1プローブに接続します。
5. ヘッドステージ出力コネクタをデータ収集システムに接....

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2.5倍広視野対物レンズ	オリンポス	MPLFLN2.5倍
40倍水浸対物レンズ	オリンポス	LUMPLFLN40XW
95%O2/5%CO2混合物	エアガス	Z02OX95R2003045
A16プローブ	ニューロネクサス	A16x1-2ミリメートル-100-177-A16	16チャンネルプローブ
麻酔ガスモニター(POET II)	批評家	602-3A
塩化カルシウム(CaCl2)	ドットサイエンティフィック	DSC20010	ACSFの
キャピラリーガラス(パッチクランプ録音)	キングプレシジョングラス株式会社	KG-33	ホウケイ酸、内径:1.1mm、外径:1.7mm、長さ:90.0mm
キャピラリーガラス(ウイルス注射)	ドラモンド・サイエンティフィック・カンパニー	3-000-203-G/X	3.5インチ
ジュニアマイクロマニピュレーターの制御	ルイグスとノイマン	SM8	ジュニアマイクロマニピュレーターの制御用
マニピュレーターとシフトテーブルの制御	ルイグスとノイマン	SM7	マルチチャンネル電極とシフトテーブルの制御用
デジデータ 1440A + クランペックス 10	分子デバイス	1440A	デジタイザとソフトウェア
E-3603チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14171208	95% O2/5% CO2 ガス混合物のインキュベーションチャンバーへの送達 + パッチクランプ時の圧力適用
エグタ	ドットサイエンティフィック	DSE57060	細胞内溶液
ERP-27 EEGリファレンス/パッチパネル	神経リンクス	引退
充填針	世界の精密機器	50821912	充填パッチクランプピペット用
イメージング用フィルターキューブ EYFP	オリンポス	U-MRFPHQの
濾紙	フィッシャーサイエンティフィック	09801E	ティッシュブロックの調製中にスライステンプレートを覆う
フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー	サッターインストゥルメント	P-1000	2.5x2.5ボックスフィラメント
ガス分散チューブ	シグマ・アルドリッチ	CLS3953312C
ガラスシリンジ(100mL)	シグマ・アルドリッチ	Z314390	ガスシール袋の充填用
グルコン酸、カリウム塩(K-グルコン酸)	ドットサイエンティフィック	DSG37020	細胞内溶液
グルコース	ドットサイエンティフィック	DSG32040	ACSFの
GTP、ナトリウム塩	シグマ・アルドリッチ	G8877	細胞内溶液
ヘッドステージプローブアダプター	ニューロネクサス	A16-OM16	16チャンネルプローブをヘッドステージ入力に接続するためのアダプター
ヘープス	ドットサイエンティフィック	DSH75030	ACSF、細胞内溶液
HS-16ヘッドステージ	神経リンクス	引退
イソフルラン	パターソン獣医	07-893-1389
イソプロピルアルコール(70%)	VWRインターナショナル	101223から746
ジュニアマイクロマニピュレーター	ルイグスとノイマン	210-100 000 0090-R	パッチクランプ電極の操作用
LED光源制御モジュール	マイテックス	BLS-PL02_US	光遺伝学的光源制御
Lynx-8アンプ	神経リンクス	引退
Lynx-8電源	神経リンクス	引退
硫酸マグネシウム(MgSO4)	ドットサイエンティフィック	DSM24300	ACSFの
mCherry, Texas レッドフィルターキューブ	彩度	49008	画像診断用 TDTomato 蛍光レポーター
メロキシカム
マイクロピペットホルダー	フィッシャーサイエンティフィック	NC9044962
マイクロシリンジポンプ	世界の精密機器	UMP3-4
マルチクランプ 700A	分子デバイス/軸索機器	700エー	増幅器
窒素(エアテーブル用)	エアガス	NI200
ナイロンメッシュ	フィッシャーサイエンティフィック	501460083	平らにされたプラチナワイヤーの馬蹄形に引き伸ばされ、録音中はこの上にスライスレスト
ナイロン、パンストからカット	ジェネリックブランド		インキュベーションチャンバーでスライスプラットフォームを作成するための小片、プラチナハープを作成するための単一繊維
ピペット	ドットサイエンティフィック	307	ティッシュをリグに転送するため
プラチナ線	VWRインターナショナル	BT124000	2 cm、平らに、プラチナハープを作るために
ポリゴン400	マイテックス	DSI-E-0470-0617-000	光遺伝学的光送達システム、PolyScan2ソフトウェアが付属
塩化カリウム(KCl)	ドットサイエンティフィック	DSP41000	ACSFの
リン酸カリウム(KH2PO4)	ドットサイエンティフィック	DSP41200	ACSFの
密封されたガスバッグ	フィッシャーサイエンティフィック	109236
顕微鏡用シフトテーブル	ルイグスとノイマン	380FMUの
重炭酸ナトリウム(HCO3-)	ドットサイエンティフィック	DSS22060	ACSFの
塩化ナトリウム(NaCl)	ドットサイエンティフィック	DSS23020	ACSF、細胞内溶液
シリンジ(1 mL)、LuerLockチップ付き	フィッシャーサイエンティフィック	309628	パッチクランプ時の圧力適用用
スリップチップ付きシリンジ(1mL)	WWグレインジャー株式会社	19G384	充填パッチクランプピペット用
シリンジフィルター	VWRインターナショナル	66064-414
正立顕微鏡	オリンポス	BX51
Wypall タオル	フィッシャーサイエンティフィック	19-042-427

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