VTAドーパミン作動性ニューロン受容体操作によるラットモデルにおけるドーパミン放出のモニタリング

要約

出典:Wickham, R. J., et al. ファシックドーパミンの腹側被蓋領域受容体調節を評価するための高速スキャンサイクリックボルタンメトリー(CIS-FSCV)による注入と刺激の組み合わせ。J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオは、麻酔をかけたラットに電極とカニューレを埋め込んで、ポテンショスタットを使用して側坐核のドーパミン放出を測定し、腹側被蓋領域のドーパミン作動性活性を調節するための薬物を注入する方法を示しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 術前準備

1. 電極溶液の調製
   1. 電極の埋め戻し溶液を作成するには、4 M酢酸カリウムと140 mM塩化カリウムの溶液を調製します。
2. 電極調製
   1. 真空吸引により、T-650炭素繊維(直径7μm)をホウケイ酸ガラスキャピラリー(長さ=100mm、直径=1.0mm、内径=0.5mm)に挿入します。
   2. 炭素繊維をガラスキャピラリーの内側に配置したら、ガラスキャピラリーを垂直電極プーラーに配置し、発熱体をキャピラリーのほぼ中央に置きます。マグネットをオフにしてヒーターを55に設定します。
   3. キャピラリーを引っ張った後、電極の先端が発熱体に囲まれないように、上部キャピラリーホルダーを慎重に持ち上げます。
   4. 鋭利なハサミを使用して、キャピラリーの2つの部分をまだ接続しているカーボンファイバーを切断します。これにより、2つの別々の炭素繊維微小電極が得られます。
   5. 光学顕微鏡下で、露出した炭素繊維を鋭利なメスで慎重に切断し、ガラスの端から約75〜100μm伸びるようにします。
   6. 光学顕微鏡を使用して、電極に毛細管に沿って亀裂がないこと、および炭素繊維が毛細血管から出るシールが目立ちにくく、亀裂がないことを確認します
      手記： 良好なシールは、録音中のノイズを減らすのに役立ちます。
3. 参照電極の作製
   1. 5cmの銀線に金のピンをはんだ付けします。
   2. アノードを金属製のペーパークリップなどの導体に、カソードをピンに取り付け、ペーパークリップと銀線を0.1M HClに沈めながら電圧(~2V)を印加します。
   3. 電圧を停止しますtage銀線に白いコーティング(AgCl)が表示されたら
   。
4. 埋め込み用電極の準備
   1. 細い絶縁線(長さ~10cm、直径<0.50mm)に金ピンをはんだ付けします。
   2. 金ピンの反対側のワイヤーから~5cmの絶縁体を取り除きます。
   3. 電極の約半分に電極溶液を充填します。
   4. 絶縁ワイヤを電極に挿入します.
      手記： ワイヤーは電極内部のカーボンファイバーと接触する必要があります。

2. 電極の埋め込み

1. 成体、雄、Sprague Dawleyラット(250-450 g)に、滅菌生理食塩水に溶解した0.5 g / mLウレタンの腹腔内注射(1.5 g / kgまたは1 mL / kg容量)を与えます。.初期ウレタン用量1.0−1.2g / kgから始めます。動物がウレタン投与の20分後に有害刺激試験(テールピンチ)にまだ反応する場合は、さらに0.3-0.5g / kgウレタンを1.5g / kgの総用量で投与します。
   手記： 0.5 g/mL ウレタン溶液を調製するには、生理食塩水 10 g (~10 mL) に 10 g のウレタンを加えます。ウレタンは発がん性物質であり、取り扱いには注意が必要です。ただし、ケタミン/キシラジンやクロラール水和物などの他の麻酔薬と同様に、ドーパミンのレベルを変更しないため、重要な麻酔薬です。
2. 動物が深く麻酔され、有害な刺激(つま先のつまみなど)に反応しなくなったら、定位固定フレームに入れます。ラットの各眼に眼科用潤滑剤を塗布します.
   手記： これは非生存的な手術ですが、優れた無菌技術が推奨されます。
3. 2段階のスクラブを使用してラットの頭皮を洗浄します(つまり、ヨードポビドンスクラブとそれに続く70%エタノールスクラブ、3サイクルの繰り返しで実行します)。
4. 滅菌した針鼻ピンセットと手術用ハサミを使用して頭皮組織を切り取ります。以下に概説するさまざまな移植のためのスペースを確保するために、かなりの量の組織を取り除きます。
5. 滅菌した綿の先端アプリケーターを使用して頭蓋骨の表面をやさしく清掃します。次に、ラムダとブレグマを特定するために、3%過酸化水素を2〜3滴塗布します。
6. 定位固定装置またはハンドドリル(1.0 mm、~20,000 rpm)を使用して、ブレグマの前方2.5 mm、ブレグマの側面3.5 mmに直径1.5 mmの穴を開けます。この穴にネジ(外径1.59 mm、長さ3.2 mm)を部分的に(約半分、しっかりと固定されるまで)埋め込みます。熱傷を防ぐために、穴あけ中に滅菌生理食塩水を使用して灌漑することをお勧めします。
7. 参照電極については、左半球のブレグマの前方1.5 mm、横方向3.5 mmに直径1.0 mmの穴を開けます。
8. 手で、この穴に~2 mmの基準線を挿入し、挿入したネジの頭の周りと下に基準線を巻き付けます。
9. ネジを完全に埋め込み、参照電極を所定の位置に固定します。
10. 右半球で、ブレグマの前方1.2 mm、横方向に直径1.5 mmの穴を開けます。
11. ピンセットを使用して硬膜をそっと取り外します。
12. 刺激電極には、ブレグマの後方5.2 mmと外側1.0 mmの中央に正方形の穴(前後2 mm、内側外側5 mm)をドリルで開けます。
13. 定位アームバーを使用して、バイポーラ刺激電極/ガイドカニューレを硬膜から5mm下に下げます。電極の埋め込み中に出血が発生した場合は、出血を最小限に抑えるために滅菌綿棒とガーゼを使用してください
    手記： この方法で使用されるバイポーラ刺激電極には、ガイドカニューレ(材料表)があらかじめ取り付けられています。このアイテムで使用される内部カニューレは、ガイドカニューレに完全に挿入されたときに、バイポーラ刺激電極のプロングとフラッシュする必要があります。これにより、内部カニューレが、約1mm離れて座っている刺激装置の2つのプロングの間に直接配置できるようになります。同様のプロトコルは、他の場所で説明されています。
14. 定位アームバーを使用して、カーボンファイバー微小電極を硬膜から4mm下に下げます。この位置は、線条体の最も背側にあります。
15. 基準線とカーボンファイバーをポテンショスタットに接続します。
16. 三角波(-0.4−1.3 V, 400 V/s)を60 Hzで15分間、10 Hzで10分間印加します< br /> 手記：通常、脳内の炭素繊維微小電極に波形を印加すると、炭素繊維の表面に酸化物基が追加されます。この反応の平衡は、記録する前に到達する必要があります。そうしないと、大きなドリフトが発生します19。電極をより高い周波数(60Hz)でサイクルすると、カーボンファイバーはより早く平衡に達することができます。

3. カーボンファイバーの最適化と電極/ガイドカニューレの位置の促進

1. 周波数 60 Hz、24 パルス、電流 300 μA、パルス幅 2 ms/位相のバイポーラ電気波形を生成するように刺激装置を設定します。
2. 刺激装置を硬膜下5mmから7.8mmまで0.2mm刻みで静かに下げます。各増分で、VTA.
   を刺激します。 手記： 背側の深さが深い(5-6 mm)と、脳の刺激により、通常(~80%)ラットのひげがけいれんします。さらに深くなると、ひげはけいれんを止め、硬膜の下7.5〜8.2mmで発生します。ひげのけいれんが止まると、刺激電極はVTAの近くまたはVTAにあります。これはすべてのラットで発生するわけではなく、ひげのけいれんの欠如は、バイポーラ刺激電極/注入カニューレが誤って配置されている兆候と見なすべきではありません。ひげのけいれんは、すべての麻酔薬(イソフルランなど)で発生するとは限りません。.
3. 刺激が炭素繊維微小電極(現在は背側線条体内)で位相性DA放出を生成するまで、バイポーラ刺激電極/ガイドカニューレを下げ続けます><。 手記： バイポーラ電極がVTAに埋め込まれている場合、背側線条体でのDA放出は常に発生するわけではありませんが、VTA刺激による背側線条体でのDA放出の観察は、通常、NAcコアで良好な信号が観察されることを示す良い兆候です。
4. 炭素繊維微小電極を硬膜から少なくとも6.0 mm下になるまで下げます。これはNAcコアの最も背側の部分です。
5. VTAを刺激し、DAピークのピーク振幅を記録します。
6. DA放出が最も大きい部位の炭素繊維微小電極を上下させます。
7. DA応答のピークが0.6Vの明確な酸化ピークと-0.2Vのリダクションピークであることを確認します。これらのピークはDAを示します。

>4. 注入と刺激の組み合わせFSCV記録

>注:図1は、VTAマイクロインフュージョンの前後の記録のタイムラインを示しています。

1. カーボンファイバーと刺激電極/ガイドカニューレの位置を最適化したら、~20−30分間刺激します
   手記： 現在の刺激パラメータの下では、小胞の再負荷を可能にするために、3分ごとに1回以上刺激しないでください22。
2. 安定したベースライン(5回の刺激で<20%の変動)を達成した後、バイポーラ刺激装置にあらかじめ取り付けられているガイドカニューレに手で内部カニューレを静かに下げます。
3. さらに2-3のベースライン記録を行い、カニューレの挿入自体が誘発された信号を変更しなかったことを確認します。場合によっては、内部カニューレの挿入と取り外しがVTAを損傷する可能性があります。このベースライン期間(>20%)で信号が大幅に変化する場合は、ベースラインが再安定するまでさらに3〜4回の録音を行います。
4. シリンジポンプとマイクロシリンジを使用して、0.5 μLの溶液(例:0.9%生理食塩水、N-メチル-D-アスパラギン酸[NMDA]、(2R)-アミノ-5-ホスホ吉草酸[AP5])をVTAに2分間注入します。
5. 注入後、除去する前に少なくとも1分間内部カニューレを離れます.
   手記： 一部の薬物は、薬物動態に基づいて内部カニューレを長時間放置する必要がある場合があり、内部カニューレを取り外すと、薬物が内部カニューレを通って戻る可能性があります。懸念がある場合は、録音全体を通して内部カニューレをガイドカニューレに残すことができます。それ以外の場合、この 1 分間隔の後に録音を開始できます。
6. 注入後の影響を測定するために、3分ごとに記録を続けます.
   手記： コントロール溶液を注入し、効果が観察されない場合は、2回目の注入が可能です10。内部カニューレの挿入または生理食塩水注入によって引き起こされたDA放出の変化がある場合、信号は通常30分以内にベースラインに回復します。

結果

図1:VTAマイクロインフュージョン前後の記録のタイムライン。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
電極充填液/消耗品
マイクロピペット	世界の精密機器	MF286-5 (28ゲージ)
酢酸カリウム	シグマ	236497から100G
塩化カリウム	シグマ	P3911-25Gの
電極供給
カーボンファイバー	ソーネル	T650
電極プーラー	成茂インターナショナル	PE-22	注:水平プーラーも使用できます
ガラスキャピラリー	A-Mシステム	626000
電極用絶縁電線	Weico Wire and Cable Incorporated(ウェイコワイヤーアンドケーブルインコーポレイテッド)	ULの1423	長さ; 10 cm; 直径, 0.4mm; カスタムメイドが必要; 絶縁材料はワイヤーの5 cmを覆う必要があります
光顕微鏡(電極の観察および切断用)	フィッシャーサイエンティフィック	M3700
ピン	フェニックスエンタープライズ	HWS1646	絶縁電極線と基準電極にはんだ付けし、ヘッドステージに接続
パテ	アルコリン	23922-1003	炭素繊維を切断しながら電極を置くために使用されます
スカルパルブレード	世界の精密機器	500239	炭素繊維を適切な長さに切断するため
シルバーワイヤー	シグマ	327026から4G
FSCVハードウェア/ソフトウェア
ファラデーケージ	Uライン	H-3618 (36インチ x 24インチ x 42インチ)
ポテンショスタット	ノースカロライナ大学 電子工学施設
刺激電極	プラスチックスワン	MS303/2-A/SPCの	ご注文の際は、台座下22mmカットをご依頼ください
TarHeel HDCV ソフトウェア	ノースカロライナ大学チャペルヒル	-	注文情報の https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/
UEIブレイクアウトボックス	ノースカロライナ大学 電子工学施設		注文情報の https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/
UEI電源	ノースカロライナ大学 電子工学施設		注文情報の https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/
スティミュレーターハードウェア
神経ログ刺激アイソレーター	デジタイマー株式会社	DS4	ニューロログ800A
輸液/刺激用品
輸液ポンプ	新時代のシリンジポンプ	NE-300
内部カニューレ	プラスチックスワン	C315I/SPC 内部 33GA
マイクロリットルシリンジ	ハミルトン	80308
チューブ	プラスチックスワン	C313CT/PKGチューブ023×050 PE50
手術用品
カニューレホルダー	コップフ・インスツルメンツ	1776 P-1
コットンチップアプリケーター	バイタリティメディカル	806
電極ホルダー	コップフ・インスツルメンツ	1770
ヒーティングパッド	ケントサイエンティフィック	RT-0501
ポビドンヨウ素	バイタリティメディカル	〒29906-004
ネジ	ストールティング	ボーンアンカービス/100本入り	外径1.59 mm、長さ3.2 mm
AgCl付き銀線リファレンス	InVivo メトリクス	E255Aシリーズ
スクエアガーゼ	バイタリティメディカル	441408
ステレオタックス	コップフ・インスツルメンツ	モデル902(デュアルアームバー)
輸液用薬
((2R)-アミノ-5-ホスホ吉草酸	シグマ・アルドリッチ	A5282の
N-メチル-D-アスパラギン酸	シグマ・アルドリッチ	M3262
メカミルアミン塩酸塩(M9020-5mg)	シグマ・アルドリッチ	M9020
スコポラミン臭化水素酸塩(S0929-1g)	シグマ・アルドリッチ	S0929

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