全細胞パッチクランプを用いたキスペプチンニューロンに対する成長ホルモンの試験効果の決定

要約

出典: Silva, J. d. N., et al., Wholamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (2023)

このビデオは、トランスフェクションされたマウス視床下部スライスからのキスペプチンニューロンの応答を測定するための全細胞パッチクランプ技術の使用を示しています。このプロセスでは、全細胞構成を達成し、電流クランプモードを使用して試験ホルモンによって誘発される膜電位変化を記録します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 記録用セルシール

1. 録音を開始する前に、すべての機器(顕微鏡、アンプ、デジタイザー、マイクロマニピュレーターなど)がオンになっていることを確認してください。
2. 市販のブランド(Table of Materials)の記録チャンバーに、記録用のaCSF溶液を顕微鏡に取り付けます。灌流ポンプを使用して、aCSFを2 mL/minの速度で常に灌流します。
3. 目的の脳スライスを(一度に1つずつ)記録チャンバーに移します。アクリル転写ピペット(シリコン乳首に取り付けられた逆パスツールガラスピペット)を使用して、視床下部スライスをチャンバーに移します。スライスアンカー(Table of Materials)を使用してスライスを保持し、aCSF灌流中にスライスが動かないようにします。
4. 顕微鏡に取り付けられた記録チャンバーの中央にスライスを置きます。スライス位置は、顕微鏡下で目的の領域を良好に観察し、記録用マイクロピペットに完全に手を伸ばすために重要です。
5. 液浸顕微鏡の低倍率対物レンズ(10倍または20倍)を使用して、スライスの位置決めと関心領域の特定を支援します。
6. 関心領域を特定した後、対物レンズを高倍率レンズ(63倍)に切り替えて組織レベルに焦点を合わせ、標的領域の細胞の内因性蛍光タンパク質と形状を観察して、脳スライスの表面にキスペプチン細胞を見つけます。
7. ターゲットの可能性のあるセルが見つかったら、コンピューター画面上でマウスカーソルでマークするか、関心のある領域に正方形などの形式を描画してマークします。コンピューターの画面マークは、記録マイクロピペットの位置をセルにガイドするのに役立ちます。
8. 標的細胞の正確な位置を決定したら、対物レンズを持ち上げ、内部溶液で満たされた記録マイクロピペットを導入します。マイクロピペットを電極ホルダーに入れるときは、内部溶液が銀電極に接触していることを確認してください.
   手記：マイクロピペットの調製、配置、電極ホルダーへの位置決め用。
9. マイクロピペットをaCSF溶液に浸す前に、マイクロピペットに異物が入らないように、ポリエチレンチューブ(ポリエチレンチューブ)を介してマイクロピペットホルダーに接続された1〜3mLの空気充填シリンジを使用して、陽圧を加えます(≈130cm長い);約100〜200μLの空気を印加します。
10. マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットを対物レンズの中心の下にガイドします。マイクロマニピュレーターのボタンを動かして、X-Y-Z軸上のマイクロピペットを目的の細胞に導きます。
11. マイクロピペットの先端が見えるようにピントを調整し、ピントをスライスに近づけすぎないようにします。マイクロマニピュレーターの速度を落とし、マイクロピペットをゆっくりと焦点面まで下げます。マイクロピペットの先端が突然スライスを貫通するのではなく、細胞/標的領域の表面に触れるまでゆっくりと下降することを確認してください。
12. マイクロピペットホルダーに取り付けられた1〜3mLの空気充填シリンジで軽い陽圧(≈100μL)を加え、アプローチ経路から破片を取り除きます。
13. 標的細胞に焦点を合わせ、マイクロマニピュレーターをX-Y-Z軸上でゆっくりと動かして、マイクロピペットをそれに近づけます。マイクロピペットを細胞に接触させると、マイクロピペットの先端から加えられた圧力によるくぼみが観察されます(図2C)。
14. ディンプルを形成した後、マイクロピペットが細胞に近接しているため、マイクロピペットホルダーに接続されたチューブを介して口から弱く短時間の吸引(1〜2秒)を印加し、マイクロピペットと細胞との間にシールを生成します(ギガオームシールまたはギガシール>1GΩ;図 2D)。シールを形成するには、ソフトウェアの電圧クランプモードを使用します。
15. シールが安定している場合(ギガオームシールは機械的に安定しており、ノイズ干渉がない必要があり、約1分間の観察によって決定されます)、保持電圧を目的の細胞の最も近い生理学的静止電位に設定します。キスペプチン視床下部ニューロンには、-50 mVが推奨されます。
16. マイクロピペットを細胞に密封して細胞膜を破砕し、経口(負圧)で短時間の吸引(陰圧)を行います(図2E)。破裂したメンブレンがマイクロピペットを詰まらせず、メンブレンのかなりの部分や細胞を引き付けないように、十分な力で吸引を行うと、適切な全細胞構成が達成されます。
17. 使用されているシステム設定マニュアルを確認してください。ソフトウェア(材料表を参照)を使用して、直列抵抗(SR)と全セル容量(WCC)をデジタルで確認し、計算します。
18. 電圧クランプモードでは、セル膜を破壊した後、全セルオプションを有効にし、全セルタブを参照する自動コマンドをクリックします。セルのSRとwccは自動的に計算され、ソフトウェアによって即座に表示されます。これらのパラメータは、材料表に記載されているアンプで膜試験を行うことによっても確認できます。
19. 細胞生存率パラメータを必ず確認してください。キスペプチンニューロンの場合、電気生理学的測定値がSR<25mΩ、入力抵抗>0.3GΩ、および保持電流絶対値<30pAであることを確認してください。AVPV/PeNKisspeptinまたはARHkisspeptinニューロンのWCCの平均値は、生殖腺無傷マウスで≈10-12 pFです。
20. 実験中のSRと細胞の定常容量を監視します。記録中にSRが20%を超えて変化しないこと、およびメンブレンの静電容量が安定
していることを確認してください。
21. ソフトウェアの設定を確認してください。実験の種類に応じて、記録用の特定のプロトコルを作成します。電流クランプモードで膜電位を記録するには、材料の表に記載されている機器を使用して、2〜4 kHzの電気生理学的信号をローパスフィルタリングし、ソフトウェアでオフラインで結果を分析します(ソフトウェア情報については、材料の表を参照してください)。
22. 全セル構成が適切に達成されたら、電圧クランプモードでシナプス電流を測定します(図2G)。静止膜電位(RMP)の変化と電流クランプモードでの誘導RMP変動を記録します(図2H)。細胞膜の脱分極などのRMPの変化は、図1に示すように、既知の薬物/神経伝達物質を浴に投与することによって誘発できます(ステップ1.2で説明)
    手記：電流クランプモードでは、正または負の電流を注入して、膜電圧を所望の電圧に保持することができます。キスペプチンニューロンの場合、通常、膜電位の自発的な変動を記録するために、ゼロ電流注入(I = 0)を設定します。

結果

図1:キスペプチンニューロンの活動に関する知識に対する全細胞パッチクランプ法の貢献をまとめた概略図。キスペプチンニューロン(緑色で表示)は、前腹側脳室および吻側脳室周囲核(AVPV/PeN)および視床下部の弓状核(ARH)に位置しています。AVPV/PeNKisspeptinおよびARHkisspeptin細胞は、視索前野(POA)および正中隆起(ME)の末端に位置するゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)ニューロンの体細胞に直接接続を送り、視床下部-下垂体軸(HPG)の調節で最高潮に達します。ホルモンなどのさまざまな神経調節物質が、AVPV/PeNKisspeptinニューロンとARHkisspeptinニューロンの活性を異なる方法で調節することが示されています。静止膜電位に対する可能な影響は、全細胞パスクランプ技術および電流クランプ記録を使用して得られた代表...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
aCSF、内部およびスライス溶液用の化合物
ATPの	シグマ・アルドリッチ/各種	A9187の
塩化カルシウム	シグマ・アルドリッチ/各種	C7902
D-(+)-グルコース	シグマ・アルドリッチ/各種	G7021
エグタ	シグマ・アルドリッチ/各種	O3777
ヘープス	シグマ・アルドリッチ/各種	H3375-J
KClの	シグマ・アルドリッチ/各種	P5405
K-グルコン酸	シグマ・アルドリッチ/各種	G4500
島	シグマ・アルドリッチ/各種	P5958
塩化マグネシウム	シグマ・アルドリッチ/各種	M9272
硫酸マグネシウム	シグマ・アルドリッチ/各種	230391
NaCl	シグマ・アルドリッチ/各種	S5886
リン酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ/各種	S5011
炭酸水素ナトリウム	シグマ・アルドリッチ/各種	S5761
機器
増幅器	分子デバイス	マルチクランプ700B
DIGIDATA 1440 低ノイズデータ収集システム	分子デバイス	DD1440
デジタル蠕動ポンプ	イスマテック	ISM833C
ファラデーケージ	TMCの	81-333-03
イメージングカメラ	ライカ	DFC 365 FX (英語
マイクロマニピュレーター	サッターインストゥルメント	卵-200
マイクロピペットプーラー	成茂	PC-10
顕微鏡	ライカ	DM6000 FS
回収室	ワーナー・インストゥルメンツ/ハーバード・デバイス	-
録音室	ワーナー・インストゥルメンツ	640277
スパーテル	フィッシャーサイエンティフィック/各種	魚-14-375-10;フィッシュ-21-401-20
ソフトウェアとシステム
AxoScope 10ソフトウェア	分子デバイス	-	Commanderソフトウェア
LAS X広視野システム	ライカ	-	画像の取得と解析
マルチクランプ 700B	分子デバイス	マルチクランプ700B	Commanderソフトウェア
PCLAMP 10 WINDOWS用ソフトウェア	分子デバイス	Pclamp 10スタンダード
ツール
Ag/AgCl電極、ペレット、1.0 mm	ワーナー・インストゥルメンツ	〒64-1309
スライスアンカー	ワーナー・インストゥルメンツ	〒64-0246

の 型 型 の シリーズ 型 ) シリーズ