微小電極アレイを用いたマウス脊髄切片における神経回路の評価

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. in vitro電気生理学

1. 脊髄切片の調製と記録のための溶液の調製
   1. 人工脳脊髄液
      手記：人工脳脊髄液(aCSF)は、界面インキュベーションチャンバーで使用され、記録開始まで、および実験中に薬物の灌流剤および希釈剤としてスライスが保存されます。詳細な構成については、表1を参照してください。
2. 118 NaCl、25 NaHCO₃、10グルコース、2.5 KCl、1 NaH₂PO₄、1 MgCl₂、および2.5 CaCl₂を含むaCSFを調製します。これには、CaCl₂を除く上記の必要量を2 Lの蒸留水に加えます。
3. 上記の溶液をカルボゲン(95%O₂、5%CO₂)で5分間泡立て、CaCl₂.
   を加えます 手記：このステップにより、CaCl₂の沈殿が防止され、溶液が曇らないようにすることができます。実験中の薬物適用では、aCSF中の薬物ストック溶液を所望の最終濃度に希釈します。

2. ショ糖置換人工脳脊髄液

>注:ショ糖置換aCSFは、解剖および脊髄スライス中に使用されます。名前が示すように、スクロースはNaClの代わりに使用され、浸透圧を維持しながらこれらの手順中のニューロンの興奮を軽減します。詳細な構成については、表1を参照してください。

1. 250スクロース、25NaHCO₃、10グルコース、2.5KCl、1NaH2PO₄、1MgCl₂、および2.5CaCl₂を含むスクロース置換aCSFを調製します。CaCl₂を除く上記すべての必要量を300mLの蒸留水に添加します。
2. 溶液をカルボゲンで5分間泡立ててから、CaCl₂を加えます。
3. 溶液を-80°Cの冷凍庫で約40分間、または溶液がスラリーを形成するまで保存します。固体の凍結を避け、スラリーの一貫性で使用してください。

3. 微小電極アレイの準備

>注:MEAの接触面は、親水性にするための前処理が必要です。

1. 実験の前に、MEAをウシ胎児血清(FBS)またはウマ血清(HS)で30分間よく満たします。
2. FBSまたはHSを取り外し、蒸留水が泡立たなくなるまで、MEAを蒸留水で約5回洗浄します。ウェルにCSFを充填し、すぐに使用できます。

>4. 急性脊髄スライスの準備

1. 100 mg / kgケタミン(i.p.)でマウスに深く麻酔をかけ、大きな手術用ハサミを使用してマウスの首を切ります。
2. ヒップのレベルで皮膚に小さな切り込みを入れて、腹部の上の皮膚を取り除きます。カットの両側の皮膚を吻側に引っ張り、すべての皮膚が取り除かれるまで、つまり胸郭の上部から骨盤の上部まで(腹側と背側の両方)に引っ張ります。
3. 体を氷の上に置き、腹側アプローチを使用して、すべての内臓を取り除き、胸骨の外側の肋骨を切断することにより、脊柱を露出させます。
4. 腹側胸郭、両方の肩甲骨(約T2で切り取られる)、および下肢と骨盤(仙骨のほぼ上部で切り取られる)を切除します。
5. 脊柱と肋骨の準備物を、氷冷したショ糖aCSFを含む解剖浴に移します。下部の背中の筋肉と取り付けられた上部肋骨にピンを通して、製剤の四隅すべて(腹面を上向きに)ピンで固定します。
6. ロンゲールで椎骨の腹面を覆うすべての筋肉と結合組織を取り除き、T12からL2の椎体のほぼ下にある腰仙骨拡大の上の椎骨領域を特定します。
7. 腰仙骨拡大領域の尾側にある椎体を切除して、脊柱管内にある脊髄へのアクセスを提供します。
8. 湾曲したスプリングハサミを使用して、椎体を吻側に持ち上げて引っ張りながら椎弓根を両側に切り込み、椎骨の腹側と背側を分離して脊髄を露出させます。
9. 椎体を切除して腰仙骨の肥大を明らかにしたら、脊髄を固定している残りの根をスプリングハサミで慎重に取り除き、臍帯が浮かぶまでします。
10. 腰仙骨の肥大の上下に吻側と尾側の切り傷で脊髄を分離し、脊髄の標的領域が「自由に浮かぶ」ようにします><。 手記：好ましいスライスの向きによって、その後のセクショニングのためにコードがどのように取り付けられるかが決まります(図1)。
11. 横方向のスライスの場合は、腰仙部を取り付けられた根で持ち上げ、中央に浅いチャネルが切られたプレカットポリスチレン(発泡スチロール)ブロック(1 cm x 1 cm x 1 cm)に置きます。シアノアクリレート接着剤(材料の表を参照)を使用して、ブロックとコードを切片作成プラットフォームに取り付け、氷冷したショ糖aCSF(スラリー)を含む切断槽に入れます
    手記： 浅いチャネルは、背側が露出し、脊髄の胸部端がブロックの下部にある状態で、脊髄を固定して方向付けするのに役立ちます。
12. 矢状スライスの場合は、切片作成プラットフォームにシアノアクリレート接着剤の細い線を置き、取り付けられた根で腰仙骨の拡大を持ち上げ、接着剤のラインに沿ってコードを配置し、一方の側面が接着剤の中にあり、もう一方の側面が上を向いていることを確認します。氷冷したショ糖aCSF(スラリー)が入ったカッティングバスに入れます。
13. 水平スライスの場合は、セクショニングプラットフォームにシアノアクリレート接着剤の細い線を置きます。付着した根で腰仙骨の拡大を持ち上げ、腰仙骨の拡大を接着剤のラインに沿って配置し、腹側表面が接着剤の中にあり、背側表面が上を向いていることを確認します。付属のルートを使用してコードを配置します。氷冷したショ糖aCSF(スラリー)が入ったカッティングバスに入れます。

5. 微小電極アレイの記録

>注:次の手順では、脊髄切片でのMEAベースの実験の記録データの使用方法について詳しく説明します。実験に応じて、いくつかのMEAデザインを使用することができます。これらの実験で使用したMEAの設計の詳細を表2と図2に示します。EgertらとThiebaudらによって、それぞれ平面および3次元(3D)MEAの詳細な設計情報が公開されています。どちらのMEAタイプも、60個の窒化チタン電極と、窒化ケイ素絶縁層、窒化チタントラックおよびコンタクトパッドで構成されています。

1. 実験セットアップ
   1. コンピュータとインターフェースボードの電源を入れ、録音ソフトウェアを起動します。
   2. 組み立て済みの録画テンプレートをロードします(図3A)。レコーダータブでその日のファイルに名前を付けます。
   3. 実験期間中、aCSFをカルボゲン(5%CO₂、95%_O2)で連続的に泡立てます。
   4. 蠕動ポンプによって制御される灌流システムをオンにします。インレットラインをaCSFに、インレットエンドを廃棄物ビーカーに入れます。灌流ラインを aCSF でプライミングします。
   5. 4-APおよびその他の薬物溶液を調製するには、ストックを50 mLのaCSFで必要な最終濃度(例:4-APの場合は200 μM)に希釈します。
2. 4-アミノピリジン(4-AP)活性
   1. インキュベーション後、aCSFを充填した先端の大型パスツールピペットを使用して、インキュベーターから1つのスライスを移します。
   2. スライスをMEAウェルに入れ、aCSFを追加します。
   3. 細い短毛の絵筆を使用して、スライスを60電極の記録アレイ上に配置します。特に3Dアレイを使用している場合は、電極を絵筆で接触させたり、電極を横切って組織を引きずったりしないでください。
      手記：MEAのレイアウトに応じて、これは正確な位置決めのために顕微鏡の助けを借りるかどうかにかかわらず行うことができます。
   4. スライスを配置した後、組織の上に加重ネットを配置して組織を所定の位置に保持し、MEA電極との良好な接触を促進します><。 手記： スライスは、ネット配置後に再配置が必要な場合があります。
   5. MEAを録音ヘッドステージに配置します(図2A、B)。
   6. 倒立顕微鏡(倍率2倍)を使用して電極上の組織の位置を確認し、できるだけ多くの電極が表在性背角(SDH)の下にあることを確認します。これらの電極は、分析中にノイズを差し引いたりアーティファクトを記録したりするために重要であるため、少なくとも2〜6個の電極がスライスに接触しないようにしてください(図2E)。
   7. カメラの電源を入れ、デバイスに接続して、分析中に使用するためにMEAを基準としたスライスの参照画像を撮影します。
   8. 記録ソフトウェアでDAQ(データ集録)を開始し、すべての電極がクリアな信号を受信していることを確認します
      手記：信号にノイズが多い場合は、ヘッドステージのクリップを外し、MEA接点パッドと金スプリング接点の両方を70%エタノールで清掃します(ラボ用ワイプを使用して、清掃後にパッドと接点が乾いていることを確認してください)。それでも信号にノイズが多い場合は、記録ソフトウェアで誤動作している電極をオフにするか、後で分析中に除外するためにメモしておいてください。
   9. 灌流インレットラインとアウトレットラインをMEAウェル(以前はaCSFで満たされていた)に取り付け、灌流システムをオンにします。流量(理想的には毎分4〜6バス容量)を確認し、流出がスーパーフューセートのオーバーフローを防ぐのに十分であることを確認してください。
   10. 組織を 5 分間平衡化した後、ろ過されていない生のベースライン データを 5 分間記録します。
   11. 灌流インレットラインを aCSF から 4-AP 溶液に移動し、4-AP によって誘発されるリズミカルな活動が定常状態に達するまで 12 分間待ちます (薬物が浴に到達するまで 2 分、活性がピークに達してからプラトーになるまで 10 分)。
   12. 4-APによる5分間の活性を記録します。その後の録音に備えて、薬物をテストしたり、4-APの安定性を確認し
   たりしてください。

>表1:人工脳脊髄液の組成。

>表2:微小電極アレイのレイアウト。

図1:脊髄スライスの向き、取り付け方法、切断方法。 (A)横方向のスライスには、支持溝が切り込まれた発泡スチロールの切断ブロックが必要です。脊髄は支持溝のブロックに寄りかかっており、コードの背側はブロックの反対側を向いています。ブロックとコードは、シアノアクリレート接着剤で切断ステージに接着されます。(B)矢状スライスは、切断ステージにシアノアクリレート接着剤の細い線を配置し、次に接着剤の上に脊髄をその側面に配置することによって調製されます。(C)水平スライスは、切断ステージにシアノアクリレート接着剤の細い線を置き、次に脊髄腹側を下にして接着剤の上に配置することによって調製されます。

図2:微小電極アレイ上の組織の位置。(A)画像は、MEAが所定の位置に配置されたオープンMEAヘッドステージを示しています。(B) Aと同じで、録音および組織灌流システムが所定の位置にあるMEAヘッドステージが閉じています。(C)画像は、メーカーから提供されたMEAを示しています。ヘッドステージの金スプリングとインターフェースするコンタクトパッドと、ティッシュバス溶液とティッシュスライスを保持するMEAティッシュバスが示されています。中央の赤い四角で強調表示されている領域は、電極アレイの位置です。(D)回路図は、この研究で使用された2つのMEA電極構成を示しており、さらに詳細を表2に示します。参照電極は青い台形で示されます。左のMEA電極レイアウトは、直径30μmの電極を200μm間隔で配置した60MEA200/30iR-Ti、または直径12μm、高さ50μmまたは40μmの電極を持つ200μm間隔および100μm間隔の3次元MEAs(60MEA200/12/50iR-Tiおよび60MEA100/12/40iR-Ti)で最もよく使用されている60電極正方形の構成を示しています。 それぞれ。左のMEA電極レイアウトは、60MEA500/30iR-Tiの6×10電極の長方形レイアウトを示しています。(E)60MEA100/12/40iR-Ti角型MEAの高倍率画像で、脊髄切片を横切って記録位置に置いたもの。スライスは電極列3〜8にあります。どの組織にも接触しない電極の最上列は、参照電極として機能します。SDH エリアは半透明のバンドとして表示されます。この場合、SDH は MEA の行 4、5、6、および列 2、3、4、5、7 の電極を覆います。スケールバー = 200 μm。略語:MEA =微小電極アレイ;SDH =表在性背角。

図3:データ記録および分析ツールのレイアウトと、細胞外活動電位と局所電界電位波形を示す微小電極アレイ記録の例。(A)回路図は、MEAデータの取得に使用される事前設定された記録テンプレートを示しています。MEA2100とレコーディング(ヘッドステージ/アンプ)ツールを連携させることで、データに名前を付けて保存することができます。生データの 4 つのサンプルトレース (右、5 分エポック) を 1 つの MEA チャネルで収集し、ベースライン、4-AP アプリケーションから 12 分後、4-AP 活性を確立してからさらに 15 分後、および TTX (1 μM) の浴アプリケーション後の活性を示しました。4-AP(2 番目のトレース)を追加すると、バックグラウンド ノイズと EAP/LFP アクティビティが明らかに増加することに注意してください。重要なことに、4-AP誘導活性が確立されてから少なくとも15分間は、活性が比較的安定している(第3のトレース)。TTX(1μM)を添加すると、すべての活性がなくなります(ボトムトレース)。(B)概略図(左)は、データ解析用のアナライザソフトウェアの構成を示しています。生データエクスプローラーツールは、記録ソフトウェアによって収集された記録をインポートするために使用されます。次に、これらのデータはクロスチャネルフィルタツールを介して実行され、選択した参照電極信号を他の電極から減算してバックグラウンドノイズが除去されます。データはEAPフィルタとLFPフィルタツールを通過し、各波形の信号対雑音関係を最適化します。この手順に続いて、EAP パス データは EAP ディテクタ ツールに入り、しきい値が設定されます。EAP は検出され、EAP アナライザー ツールに送信され、各イベントの待機時間が記録され、txt としてエクスポートされます。ファイル。LFP データに対しても、対応する LFP ツールキットを使用して同じワークフローが発生します。右のトレースは、さまざまな細胞外波形を含む単一のMEAチャネルからのデータを示しています。EAPおよびLFP信号の位置は、上記の「カウントラスター」で強調表示されています。下のトレースは、さまざまなLFP信号(さまざまな外観に注意)や個々の細胞外EAP(赤い円)を含む、拡張されたタイムスケールでの波形を示す上部の記録からのエポックです(赤いバーで示されています)。LFP/EAPの波形と極性は、これらの信号を生成するニューロンの数、記録電極への近接性、および近くの電極に対する位置によって異なることに注意してください。略語:MEA =微小電極アレイ;EAP = 細胞外活動電位;LFP = 局所電界電位;4-AP = 4-アミノピリジン;TTX = テトロドトキシン。