ラットにおける動脈圧応答性腎交感神経活動の変化の記録

要約

出典:Fink, A. M., et al.麻酔ラットにおける中枢神経系操作に応答した腎交感神経活動の急激な変化の定量化。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオは、ラットの動脈圧の変化に応答した腎交感神経(RSN)の活動を研究する技術を示しています。大腿動脈に感圧カテーテルを装着すると、腎交感神経が露出します。次に、神経は記録電極上に持ち上げられ、その電気的活動が記録されます。次に、血管収縮薬を注射して血圧を上昇させ、対応するRSN活性の変化を監視します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. バイポーラRSNA電極の作成

1. 電極を作成するには、長さ約18mmのステンレス鋼線を2本切断します。ポリエチレン(PE-50)チューブを約15mmの長さで1本カットします。両方のワイヤーをチューブに送り込み、ワイヤーを両端から突き出たままにします。
2. ワイヤーの端から絶縁体を剥がし、ワイヤーをトリミングして、露出したワイヤーを2〜3 mm残します。一方の端で、露出したワイヤにオスピンを圧着します。ピンをワイヤにしっかりとはんだ付けし、ピンをコネクタストリップ内に固定し、接続部をエポキシで覆います
   手記：はんだ付けを避ける別のアプローチは、クイックコネクト/リリースワニ口クリップを使用することです。
3. 電極の反対側の端で、ワイヤーの端から絶縁体を剥がし、露出したワイヤーを2〜3mm残します。ワイヤのこの部分を曲げて、絶縁されていないワイヤに小さな「V」字型のフックを作成します。
   手記： これは、腎交感神経と接触する電極の部分です。液体がチューブに入るのを防ぐために、この端を密閉することが重要です。シリコーンまたはエポキシを効果的に使用できます。

2. 麻酔をかけ、手術部位を整え

る

1. 雄のSprague Dawleyラット(生後9〜11週、体重150〜400 g)に麻酔を施します。ペントバルビタールナトリウム50 mg / kgを腹腔内(IP)注射で投与します。.手術中の麻酔の安定した面を評価するには、15分ごとにつま先つま先つまみ反射をチェックし、必要に応じて麻酔を再投与します.
   手記：ペントバルビタールナトリウム(ネンブタール)は、RSNAの調節を妨げることなく持続的な麻酔面を達成するために以前の研究で使用されました。このプロトコルは非生存手術用であるため、回復/術後のモニタリング期間はありません。
2. 施設の動物管理ガイドラインに従って手術部位を準備します(すなわち、ラットの腹部、背中、および頭を剃り、10%ポビドンヨード溶液で皮膚を洗浄し、眼の潤滑剤を塗布し、ラットを加熱パッドの上に置きます)。実験中は体温を37°Cに保ちます。

3. 大腿動脈をカニューレして平均動脈圧モニタリングを行う

1. 顕微鏡で動脈を視覚化します。静脈カニューレ挿入に使用される方法と同様に、遠位縫合糸を結んで動脈を閉塞します。この縫合糸の端をシルクテープで手術野に固定し、動脈を外科医の利き手に対して垂直に配置します。
2. テレメトリを使用する場合の動脈アクセス
   1. 動脈カニューレ挿入の前に、圧力感知カテーテルを高倍率で検査します。カテーテルに気泡/破片がなく、液体で満たされた(近位)コンポーネントとゲルで満たされた(遠位)コンポーネントの間に無傷の半月板があることを確認してください。各移植の前に、カテーテルの遠位端でゲルを補充します。磁石を使用して送信機の電源を入れます。手術中に血圧(BP)を監視して、完璧な配置に耐えます。
   2. 近位縫合糸に緩いオーバーハンドハーフノットを使用して、大腿動脈を短時間閉塞します。カテーテルイントロデューサーを利き手ではない手で持ちます。テレメトリーユニットのカニューレの先端を血管カニューレ鉗子で保持して、先端からゲルがずれないようにします。
   3. 曲げた22G針で動脈に穴を開け、血管カニューレ鉗子を使用してカニューレを動脈に挿入し、先端からゲルがずれるのを防ぎます。カニューレをできるだけ進めます。近位と遠位の縫合糸タイを使用して、圧力カテーテルを固定します。
   4. テレメトリーインプラントの本体を切開部に隣接する側面の内側に押し込み、カッティングニードルの4-0ナイロン縫合糸を使用してこの切開部を閉じます。記録期間の終了時にテレメトリデバイスの電源を磁石でオフにして、バッテリーの寿命を節約します。

4. ラットを脳定位手術フレームに配置して、脳にアクセスします

1. ラットを脳定位固定術フレームの腹臥位にゆっくりと動かします。
2. ラットをイヤーバーの間に置き、切歯バーを調整してラムダとブレグマの高さを等しくします。ポジショニングは、ラットの緊張、体重、および中枢神経系(CNS)ターゲットの位置によって異なります。
3. 頭皮の正中線から2cmの吻尾側メスを切開します。綿の先端のアプリケーターを使用して、頭蓋骨の表面から結合組織をしっかりと取り除きます。過酸化水素を頭蓋骨に塗布して、ブレグマ、ラムダ、および正中線縫合糸の視覚化を支援します。
4. ラットの脳のアトラスを使用してターゲティングをガイドし、頭蓋骨を通して電極アクセス用のサイズのバーホール骨切り術をドリルで穴を開けます。

5. 腎臓の交感神経の分離

1. ワイヤーRSNA電極(ステップ1.1-1.3)を10Xプリアンプと微小電極アンプに接続します。
2. ラットが定位固定装置フレームに固定される前または後に、後腹膜切開を通じて腎神経を分離します。.ラットが定位固定装置フレームに入ったら、RSNA電極を配置します。肋骨の4〜5 cm下から尾側、脊椎のわずかに外側に伸びるメス切開を行います。ブラントは切開部を解剖し、傍脊髄筋を可視化します。
3. ハサミを使用して、脂肪が筋肉と出会う場所に非常に表面的な1〜2cmの吻尾側切開を行います。綿の先端のアプリケーターを使用して、脂肪を筋肉から離して広げ、腎臓を視覚化します。腹腔に入らないことが重要です。
4. リトラクターを使用して腎臓を傍脊髄筋から優しく分離し、腎動脈と腹部大動脈を視覚化します。腎神経の損傷を避けるために、血管を過度に伸ばさないでください。生理食塩水に浸した2インチx2インチの綿ガーゼパッドを使用して、腎臓を損傷から保護します。
5. 高倍率で、切開ポケット内の腎神経を特定します。神経束は、大動脈と腎動脈によって形成される直角で最も簡単に見えます。腎神経は、大動脈から腎臓まで腎動脈に密接に追従しています。
6. 記録電極に配置される神経束のセグメントを選択します。マイクロ解剖ピンセットを使用して、周囲の組織/血管から神経線維を穏やかに解剖します。
7. ワイヤーRSNA電極をホルダー(サポートスタンドに取り付けられたワニ口クリップなど)に固定します。電極を神経セグメントのレベルまで下げます。神経フックを使用して、神経を伸ばさずに腎神経のセグメントを電極上にそっと持ち上げます。
   手記：神経は、神経に平行な、絶縁されていないワイヤーの両方の「V」字型フックの内側にある必要があります。電極線は、他の組織、血液、またはリンパ液に触れてはなりません。
8. 露出した腎交感神経が乾燥するのを防ぐために、切開部にミネラルオイルを充填します。一方の端を切開部の皮膚に、もう一方の端をファラデーケージに取り付けた接地クリップを使用します。
9. ハイパスおよびローパスフィルタリング(10 Hzおよび3 kHz)を使用して、信号をアンプに送ります。ゲインを最大10 Kまで調整します。RSNAのバーストパターンを評価するためのオーディオモニタを含めます。2,000 Hz から 10,000 Hz の範囲のサンプリング レートを使用します。CNS の操作が急速または短時間の交感神経反応を引き起こすと仮定される場合は、サンプリング レートを上げます。

6. データの記録

1. 1 mL の生理食塩水または 10 μg/mL フェニレフリン (0.1 mL 中) のボーラス注射で圧反射を誘発することにより、RSNA 記録の品質を評価します。図1に示すように、注入はBPを増加させ、RSNAを阻害する必要があります。腎交感神経阻害には、平均動脈圧が60〜80 mmHg上昇するのに十分です。.
2. 必要に応じて、電極の位置を調整して信号を改善します。神経が電極の両方のフックに接触していない場合、または組織、血液、またはリンパ液がワイヤーに接触している場合は、再配置が必要です。
   手記： リポジショニングの必要性は、神経放電の聴覚特性に基づいています。
3. 明確な信号が得られたら、鉱物油を引き出し、切開ポケットの神経/電極接続を覆うためにシリカゲルを塗布して、RSNA電極を所定の位置に固定します。ゲルが完全に固まる前にラットを動かさないでください。
4. RSNAと平均動脈圧を継続的に記録しながら、CNS操作プロトコルを実行します。マイクロインジェクター/パルサーを脳幹操作に使用する場合、このデバイスからの論理信号をRSNA/BP記録に導入して、CNS操作のタイミングを文書化することができます。
5. 実験が完了したら、シリカゲルと脊髄筋の間の記録電極に近接する神経を粉砕して、ノイズレベルを決定します。RSNA のこの "ゼロ" 値の少なくとも 30 秒を記録します。ノイズを定量化するための別のアプローチとして、アトロピン、ヘキサメトニウム、クロリソンダミン、酒石酸ペントリニウムなどの短時間作用型神経節遮断薬を投与します。
6. RSNA電極を慎重に取り外し、ワイヤー電極から微量のシリカゲルを取り除きます。電極は再利用のために保存してください。テレメトリー送信機の電源を切って取り外し、カテーテルの先端を傷つけないように注意してください。

結果

図1:フェニレフリン注射に対するRSNAとBP IV。生のRSNA(A)は全波整流されました(B)。整流された破砕された「ゼロ」RSNAは挿入図Cで示されています。重複しない10秒の平均(ノイズを除いたもの)を計算しました(D)。圧反射を呼び起こすために、0.1 mL のフェニレフリン (1 μg/mL) を静脈内注射しました (矢印)。ボーラス注入は、BPの急激な増加とRSNAの一時的な阻害を誘発しました。.pedunculopontineテグメンタムは、ネンブタール麻酔ラットの腎交感神経活動と心肺活動を制御します

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ステンレス鋼線	AMシステムズ;スクイム、ワシントン州	791000	RSNA電極
ポリエチレン(PE-50)チューブ	VWRの;ペンシルバニア州ラドナー	〒63019-048	RSNA電極、血管カニューレ挿入
ミニチュアピンコネクタ	AMシステムズ;スクイム、ワシントン州	520200	RSNA電極
圧着工具	ダニエルズマニュファクチャリングコーポレーション;フロリダ州オーランド	M22520	RSNA電極
コネクタストリップ	アンフェノール;ミシガン州クリントンタウンシップ	〒221-2653	RSNA電極
J-B Kwikエポキシ	JB溶接、サルファースプリングス、テキサス州	8270	RSNA電極
シリコーン	パーマテックス;コネチカット州ハートフォード	2222名	RSNA電極
ヘパリンナトリウム;注射用(10 mLバイアル、1000 U / mL)	KV獣医供給;デビッドシティ、ネブラスカ州	P03466	静脈ライン開存性
フェニレフリンHCl;注射用(1 mLバイアル、10 mg / mL)	ACE外科用サプライ;マサチューセッツ州ブロックトン	〒950-6312	腎交感神経阻害のテスト
シングルフック伸縮性外科用ステー	ハーバード装置;マサチューセッツ州ホリストン	〒72-2595	切開
シルクサージカルテープ	3M、ミネソタ州ミネアポリス	1538年0月	安全な手術用ステー
針、20 g	Sigma-Aldrich; ミズーリ州セントルイス	Z192554-100EA	血管カニューレ挿入
デュモン#7湾曲鉗子	ファインサイエンスツール;カリフォルニア州フォスターシティ	11274から20	血管カニューレ挿入
5-0シルク縫合ネクタイ	ブレインツリーサイエンティフィック;マサチューセッツ州ブレインツリー	SUT-S 106	血管カニューレ挿入
繊細な止血鉗子	ロボズ外科用器具株式会社;メリーランド州ゲイサーズバーグ	RS-7117	血管カニューレ挿入とRSNA手術
Crile止血鉗子	ファインサイエンスツール;カリフォルニア州フォスターシティ	13004-14	針の曲げ
遠隔測定送信機	データサイエンスインターナショナル;ミネソタ州ミネアポリス	PA-10	平均動脈圧モニタリング(テレメトリ)
Re-gelシリンジ	データサイエンスインターナショナル;ミネソタ州ミネアポリス	〒276-0038-001	送信機の再利用(テレメトリ)
使い捨て圧力トランスデューサ	トランスパック;カリフォルニア州サンクレメンテ	MI-1224	平均動脈圧モニタリング
クリアカフ圧力注入器	MILAインターナショナル株式会社;ケンタッキー州フローレンス	2281339	平均動脈圧モニタリング
血管カニューレ挿入鉗子	ファインサイエンスツール;カリフォルニア州フォスターシティ	00574-11	カテーテル挿入
逆の切断針の黒いモノフィラメントのナイロン4-0縫合糸	マッケソンメディカル-外科;カリフォルニア州サンフランシスコ	S661GX	安全なテレメトリ送信機
テレメトリー受信機	データサイエンスインターナショナル;ミネソタ州ミネアポリス	RPC-1	平均動脈圧モニタリング(テレメトリ)
LabChart Pro(ソフトウェア)、PowerLab(取得ハードウェア)	ADインスツルメンツ;コロラドスプリングス、コロラド州	ML846、MX2マトリックス2.0(Data Science Internationalテレメトリーと互換性があります)	ソフトウェア/アクイジションハードウェアの3つのオプション
SciWorks(ソフトウェア)、DataWave(データ収集ハードウェア)	DataWave Technologies、コロラド州ラブランド	該当なし
Spike 2(ソフトウェア)、Micro1401-3	Cambridge Electronic Design Ltd.、ロンドン、英国	1401-3
マイクロドリル	ロボズ外科用器具株式会社;メリーランド州ゲイサーズバーグ	RS-6300	CNS手術
脳定位固定装置用手術用フレーム	ストールティング;ウッドデール、イリノイ州	51600	CNS手術
10倍プリアンプ付き微小電極アンプ	AMシステムズ;スクイム、ワシントン州	1800-2	RSNA録音
リトラクター	ファインサイエンスツール;カリフォルニア州フォスターシティ	17009-07	RSNA録音
マイクロ解剖ピンセット	ファインサイエンスツール;カリフォルニア州フォスターシティ	11251から10	RSNA録音
マイクロフック	ファインサイエンスツール;カリフォルニア州フォスターシティ	10064から14	RSNA録音
鉱油	フィッシャーサイエンティフィック;マサチューセッツ州ウォルサム	〒8042*47-5	RSNA録音
オーディオモニター	AMシステムズ;スクイム、ワシントン州	3300	RSNA録音
シリカゲル	ヴァッカー、ミュンヘン;ドイツ	RT601A-Bの	RSNA録音
電気クリップ	タイコエレクトロニクス;シャフハウゼン(スイス)	EB0283-000	灌流針の接地または固定
ボンハサミ、ストレート/シャープポイント	ロボズ外科用器具株式会社;メリーランド州ゲイサーズバーグ	RS-5840	灌 流
強制針	ハーバード装置;マサチューセッツ州ホリストン	〒75-0286	灌 流
Masterflex灌流ポンプ	コール・パーマー;イリノイ州バーノンヒルズ	7524から10	灌 流
Masterflexプラチナ硬化シリコーンチューブ	コール・パーマー;イリノイ州バーノンヒルズ	96410から15	灌 流
ホルマリン(10%緩衝液; 4 L)	Sigma-Aldrich; ミズーリ州セントルイス	HT501128	灌 流
蔗糖	Sigma-Aldrich; ミズーリ州セントルイス	S0389	凍結保護