マウス脳スライスにおける再プログラムニューロンの電気生理学的記録

要約

出典:Pereira, M., et al. In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオは、トランスフェクションされたマウス線条体スライスのグリア細胞の成熟とニューロンへの再プログラミングを評価するためのプロトコルを示しています。この実験では、ニューロン特異的な蛍光マーカーと電気生理学的手法を使用して、静止膜電位と電流注入に対する応答を測定します。これらの測定中の電圧スパイクは、ニューロンの成熟と再プログラミングが成功したことを示しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 全細胞パッチクランプ録音

1. 最初の組織切片を、クレブス溶液の連続流に浸した記録チャンバーに移します。軽量を使用してセクションを取り付け、対物レンズを水没させます。
2. 顕微鏡で線条体領域を特定し、GFP陽性(再プログラム)ニューロンを検索します。形態が広範囲で、繊維束や血管で覆われていないニューロンを選択します。
3. パッチング用のホウケイ酸ガラスピペット(3〜7MΩ)を調製し、次の細胞内溶液(mM単位)を充填します:122.5グルコン酸カリウム、12.5 KCl、0.2 EGTA、10 HEPES、2 MgATP、0.3 Na₃GTP、および8 NaClをKOHでpH 7.3に調整します。
4. ガラスピペットを記録電極に取り付け、溶液に浸します。電極の抵抗を再確認してください。次に、ピペットでゆっくりとセルに近づき、電極にわずかな正圧を保ちながら、先端を詰まらせないようにします.
   注意：電極を下降させる間は細胞を追跡し、細胞内の蛍光を漂白しないように注意してください(つまり、蛍光ランプが必要ない場合はオフにします)。
5. 電極の陽圧を使用して周囲の組織を注意深くすすぎ、電極で細胞に近づきます。電極をセルの真上に配置して、電極が膜に触れるまで下降します。電極と細胞膜の間にギガΩシールを作り、負圧パルスで膜を破裂させて全細胞パッチを作成します
   注意：再プログラムされたニューロンは敏感です。パッチングには注意し、Giga-Ωシールに到達したり、細胞膜を開いたりするときには、負圧をかけすぎないように注意してください。また、高齢の動物にパッチを当てるには、結合組織が厚く、ニューロンを視覚化するのが難しいため、練習と忍耐が必要です。
6. 電流クランプモードで慣らした直後の静止膜電位を確認し、分析のために書き留めてください。
7. 電流クランプでは、セルを-60mVから-80mVに維持し、-20pAから+90pAまで500msの電流を注入し、活動電位を誘導するために10pA刻
みで注入します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NaCl	シグマ・アルドリッチ	S3014
KClの	シグマ・アルドリッチ	P9333型
NaH2PO4-H 2O	シグマ・アルドリッチ	S9638
MgCl2-6 H2O	シグマ・アルドリッチ	M2670
CaCl2-6 H2O	シグマ・アルドリッチ	C8106
MgSO4-7 H2O	シグマ・アルドリッチ	230391
NaHCO3	シグマ・アルドリッチ	S5761
グルコース	シグマ・アルドリッチ	G7021
島	シグマ・アルドリッチ	P5958-500G
K-D-グルコン酸	シグマ・アルドリッチ	G4500シグマ
KClの	シグマ・アルドリッチ	P9541
KOH-EGTA(エチレングリコール-ビス-N-テトラシン酸)	シグマ・アルドリッチ	E3889 シグマ
KOH-ヘペス酸(N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸)	シグマ・アルドリッチ	H7523-J
NaCl	シグマ・アルドリッチ	S3014
Mg2ATP	シグマ・アルドリッチ	A9187の
ナ3GTP	シグマ・アルドリッチ	G8877
氷
ホウケイ酸ガラス製ピペット	サッターカンパニー	B150-86-10
ガラスキャピラリープーラー	サッター社	P-1000
ウォーターバス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	TSGP02
Clampfitソフトウェア	分子デバイス