トランスジェニックマウスの脳内への光学窓の搭載による神経活動の画像化

要約

出典:Lin, X., et al. Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオは、トランスジェニックマウスの光学窓を通して脳の神経活動を記録する方法を示しています。マウスは、神経活動の検出を可能にする蛍光タンパク質を発現します。頭蓋骨のごく一部を慎重に取り外して光学窓を設置し、その後、頭蓋骨を黒いセメントで覆って光を遮断してからイメージングします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 動物をイメージングするための準備

1. 滅菌ガーゼ、綿棒、オートクレーブ滅菌した手術器具を手術エリアに置きます。手術器具の手術間滅菌のためにマイクロビーズ滅菌器の電源を入れます。
2. マウス(雄または雌、1.5〜2.5か月、20〜25 g)に麻酔をかけ、ケタミン(17.2 mg / mL)、キシラジン(0.475 mg / mL)、アセプロマジン(0.238 mg / mL)(6 μL / g体重)の混合物の腹腔内注射(i.p.)により麻酔します。.動物がつま先のつま先つまみの刺激に反応しなくなり、角膜反射がなくなったら、麻酔の適切な深さに達するまで待ちます。手術中は、元の麻酔状態を維持するために、必要に応じて麻酔カクテルの元の用量の1/3の追加用量を与えます。.
3. 手術前に鎮痛剤としてブプレノルフィンを皮下注射します(皮下; 0.05〜0.10 mg / kg)。角膜の乾燥や白内障の形成を防ぐために、動物の目に保護軟膏を塗布します。
4. GCaMP6sトランスジェニックマウスを温熱パッドに載せて低体温症を予防し、滅菌済みの外科用ドレープで覆います。マウス用のヘッドホールディングアダプターで動物の頭を安定させます。
5. 両刃のカミソリの刃で頭皮の大部分を剃ります。滅菌アルコール調製パッドで手術部位を洗浄し、続いてポビドンヨード溶液を洗浄します。

2. 慢性的な頭蓋窓の準備

1. 頭蓋骨の片側(右側)にハサミで頭皮(2 mm x 3 mm)を長方形に切り込みます。綿棒で皮膚を脇に押して、直径>3mmの露出領域を作成します(図1A)。鈍い顕微鏡手術用ブレード(Scalpel Blade #10;図1C)。
2. デンタルドリルを使用して、頭蓋骨に円(直径3 mm、中心座標:ブレグマから-1.5 mm、正中線から2.5 mm)をそっと描き、S1領域に印を付けます(図2B)。
3. 左頭蓋骨についても同じ手順を実行します(図2B)。
4. シアノアクリレート瞬間接着剤の薄層を骨に塗布して、歯科用セメント塗布のベースを提供します。
5. 解剖顕微鏡下で、高速マイクロドリルを使用して、S1領域の周りの頭蓋骨の円形の溝を薄くします(図1D)。目的は、光学窓をその上に配置するための滑らかなエッジを作成することです。
6. 間伐プロセス中に定期的に頭蓋骨に人工脳脊髄液(ACSF、室温)を繰り返し塗布して、穴あけを容易にし、熱を放散します。摩擦による過熱を避けるために、断続的に穴あけを行います。家の真空ラインまたは真空ポンプで骨の破片を吸い取ります。
7. 骨の約2/3の深さを穿孔した後、頭蓋骨の円形部分(骨フラップ)が周囲の頭蓋骨から完全になくなるまで、残りの1/3の骨をゆっくりと慎重に薄くします。
8. #5/45鉗子のペアで円形骨フラップをゆっくりと慎重に取り外し、硬膜を露出させます(図2C;図 1E)。
9. 露出した脳領域をACSFで湿らせておきます(図1E)。出血は脳の血流を変化させ、脳の腫れを加速し、画像品質を著しく低下させるため、雌孔血管の損傷を避けてください。
10. 頭蓋骨の左側(反対側)で同じ手順を実行します。
11. 光学窓を組み立てるには、光学接着剤を使用して、カバーガラス層間を一度に1つずつ接着して硬化させます。必要に応じて、インキュベーターで光学窓(50°Cで12時間)を温め、接着剤の接着を強化します。光学窓には2つの部分があり、上部には直径5mmの丸いカバーガラスが1枚、下部には直径3mmの丸いカバーガラスが1〜3枚入っています(図2D)。
12. 光学窓をエタノール(70%、vol / vol)で保管し、滅菌生理食塩水ですすいでから使用してください。光学窓を取り付ける前に、光学接着剤の量が間違っている、ステレオスコープでの位置合わせが不正確であるなど、光学窓に欠陥がないか確認してください。
13. 開頭術領域に光学窓を取り付けます(図2D)。光学窓の上部は頭蓋骨に載っており、光学窓の下部は開頭した開口部に収まり、CSFの存在下で硬膜にかかっています(図2D、E)。
14. 光学窓の端の上部を頭蓋骨にシアノアクリレート瞬間接着剤で密封します(図2F;図1F)。
15. シアノアクリレート瞬間接着剤が乾いたら、ガラスの端を覆うために黒い歯科用セメント(デンツプライ)を塗布します。露出した頭蓋骨と創傷の縁すべてにデンタルセメントを塗布して、光を遮断します(図2G-H;図1B)。
16. 左側でも同じ手順を実行します。
17. 動物が加熱パッドで回復するのを許し、適切な監視の下で回復するために動物を自宅のケージに戻します。咀嚼と水分補給を容易にするためにウェットフードを提供します。痛みを軽減するために、ブプレノルフィン皮下(0.05〜2.0 mg / kg)を損傷後8〜12時間ごとに2日間投与します。.イメージングする前に、マウスをさらに7〜10日間回復させます。

結果

図 1.頭蓋骨の両側の窓の作成。(A)写真画像は、S1領域を覆う頭蓋骨の両側に2つの頭蓋光学窓を示しています。(B)画像の枠付き領域の高倍率(A)は、下にある硬膜と血管を露出させる両側の光学窓を示しています。スケールバー = 680 μm. (C) 露出した頭蓋骨。(D)中央の骨皮弁が見える円形の溝の作成。スケールバー=900μm.(E)骨弁を切除した後、頭蓋開口部を人工脳脊髄液(ACSF)で満たしました。スケールバー = 720 μm. (F) 頭蓋開口部に光学窓を取り付け、窓の端を瞬間接着剤でシールします。硬膜と血管は光学窓を通して見えます。スケールバー = 600 μm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C57BL/6J-TG(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	ジャクソン	24275	皮質の興奮性ニューロンのサブセットにおいて緑色蛍光カルシウム指示薬GCaMPを発現する遺伝的にコードされたニューロン指示薬およびエフェクターによって作製される任意の株であり得る。
B6です。Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	ジャクソン	7919	皮質内の特定の集団内のニューロンのサブセットでEGFPを発現する任意の株であり得、明るく生命力のあるゴルジ様染色を提供する。
デュモン No.5 鉗子、スタンダード、デュモクセル	ファインサイエンスツール	11251から30	任意のブランドを選択できます。
デュモン No. 5SF 鉗子	ファインサイエンスツール	11252から00	任意のブランドを選択できます。
マイクロビーズ滅菌器	サザンラボウェア	B1201	任意のブランドを選択できます。
ハリシゲ製SG-4Nヘッドホールディングアダプター	トライテックリサーチ	SG-4N	任意のブランドを選択できます。
理想的なマイクロドリルコンプリートキット	ハーバード大学装置	〒72-6065	任意のブランドを選択できます。
マイクロドリル用バリ	ファインサイエンスツール	19007-05	任意のブランドを選択できます。
丸型カバーガラス, 3 mm	ハーバードバイオサイエンス	W4 64-0720	任意のブランドを選択できます。
丸型カバーガラス, 5 mm	ハーバードバイオサイエンス	W4 64-0700	任意のブランドを選択できます。
Norland光学接着剤	ノーランドプロダクツ	7106	任意のブランドを選択できます。
ロックタイト液体瞬間接着剤	WBメイソン	LOC1647358	任意のブランドを選択できます。
グリップ・セメント・キット、粉末および溶剤	デンツプライ	675570	任意のブランドを選択できます。白い歯科用セメントパウダー(グリップセメント)5部と黒いテンペラパウダーペイント1部を混ぜます(光から遮蔽するため、一部のユーザーは10:1の比率を好みます)。
ジェルフォーム	ムーアメディカル	2928	任意のブランドを選択できます。
マイクロ解剖ハサミ	ロボズ	RS-5841	任意のブランドを選択できます。
人工脳脊髄液(ASF)	-	-	ACSFには、125 mM NaCl、4.5 mM KCl、26 mM NaHCO3、1.25 mM NaH2PO4、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、および20 mMグルコースが含まれています。ACSFを酸素(95%酸素、5%二酸化炭素)で泡立て、pHを7.4に調整します。すべての実験の前に、新しいACSF溶液を準備します。

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