脊髄切片のゼラチノーサニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録

要約

出典:Zhu, M., et al.実質ゼラチノーサニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録のための急性脊髄スライスの調製。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオは、全細胞パッチクランプ技術を使用してニューロンの発火パターンを分析するために、脊髄切片のゼラチノーサ(SG)ニューロンで電気生理学的記録を実行する手順を示しています。この方法により、脊髄のSGニューロンの刺激に対する神経応答の研究が可能になります。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査によってレビューされ、承認されています。

1. 溶液と材料の準備

1. ソリューション
   1. 人工脳脊髄液(ACSF)(mM)を調製する:117塩化ナトリウム(NaCl)、3.6塩化カリウム(KCl)、1.2リン酸二水素ナトリウム二水和物(_NaH2PO4・2H₂O)、2.5塩化カルシウム二水和物(CaCl₂・2H₂O)、1.2塩化マグネシウム六水和物(MgCl₂・6H₂O)、25重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)、11 D-グルコース、0.4アスコルビン酸、 ピルビン酸ナトリウム2個。表 1 を参照してください。
   2. K⁺ベースの細胞内溶液(mM単位)を調製します:130 K-グルコン酸、5 KCl、10 Na₂-ホスホクレアチン、0.5エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N、N、N'、N'-四酢酸(EGTA)、10 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、4マグネシウムアデノシン三リン酸(Mg-ATP)、および0.3グアノシン三リン酸リチウム(Li-GTP)。表 2 を参照してください。
   3. セシウム(Cs⁺)ベースの細胞内溶液(mM単位)を調製します:92セシウムメタンスルホン酸(CsMeSO₄)、43塩化セシウム(CsCl)、10Na₂-ホスホクレアチン、5テトラエチルアンモニウム(TEA)-Cl、0.5 EGTA、10 HEPES、4 Mg-ATP、および0.3 Li-GTP。表 3.
      を参照してください。 手記：すべての溶液は蒸留水を使用して調製する必要があります。ACSFおよびスクロース-ACSFは、最適なpHを約7.4に維持するために、使用前にカルボジン化(95%O₂および5%CO₂混合物)する必要があり、これら2つの溶液の浸透圧を300〜310ミリオスモル(mOsm)に調整する必要があります。アスコルビン酸はカルシウムチャネルに影響を与える可能性があるため、カルシウム電流を記録したい場合は、この薬剤を省略する必要があります。細胞内溶液の浸透圧とpHを測定し、それぞれ290〜300 mOsmと7.2〜7.3に調整する必要があります。Cs⁺およびTEAは、カリウムチャネルをブロックするためにCs⁺ベースの細胞内溶液に適用され、抑制性シナプス後電流(IPSC)を記録するときに膜電位を0mVで安定させるために増幅器を使用するのに役立ちます。
2. 楽器
   1. 一般的な電気生理学的システムには、赤外微分干渉コントラスト(IR-DIC)と高分解能水浸対物レンズを備えた正立顕微鏡、CCD/CMOSカメラ、パッチクランプアンプ、マイクロピペットホルダー、ピペット位置の微調整が可能なマイクロマニピュレーターを使用します。顕微鏡を動かすためには、XYステージも必要です。
   2. すべての機器をファラデーケージに囲まれた防振テーブルに取り付けます。ビデオカメラにビデオモニターを接続して、ニューロンを観察し、マイクロピペットを視覚化します。
3. マイクロピペット
   1. マイクロピペットプーラーを使用して、ホウケイ酸ガラスキャピラリーから記録電極を作成します。一般的なピペット抵抗は、細胞内溶液で満たされた場合、3〜6MΩの範囲です。

2. 全細胞パッチクランプ録音

1. ゼラチノーサ(SG)ニューロンから全細胞パッチクランプ記録を行うには、ほとんどの記録例にK⁺ベースの細胞内溶液を使用し、抑制性シナプス後電流の記録にのみCs⁺ベースの溶液を適用します。
2. 脊髄スライスを録音室にそっと移動させた後、ナイロン糸でしっかりと取り付けたU字型のプラチナワイヤーで保持すると、スライスの安定性が最適になります。重力システムを介してRTで気泡ACSFでスライスを着実に灌流し、灌流速度を2〜4 mL / minに設定して十分な酸素化を実現します。
3. 低解像度の顕微鏡レンズでSG(半透明のバンド)の領域を特定し、高解像度の対物レンズをターゲット細胞として健康なニューロンを選択し、ビデオモニター画面の中央に調整します。
4. 必要に応じて、マイクロピペットに適切な量のK⁺ベースまたはCs⁺ベースの細胞内溶液を充填し、マイクロピペットを電極ホルダーに挿入し、細胞内溶液がホルダー内の銀線に接触することを確認します。
5. マイクロピペットにピントを合わせ、マイクロマニピュレーターを使用してACSFに浸し、穏やかな陽圧(マノメーターで測定した場合は~1 psi)を加えて、マイクロピペットを汚れや破片から遠ざけます。
6. マイクロピペットを徐々に標的ニューロンに向けて動かします。ピペットがニューロンに近づいたら陽圧を解放すると、ニューロン膜に非常に小さなくぼみが形成されてギガシールが形成されます。
7. 保持電位を、細胞の生理学的静止膜電位(RMP)に近い-70mVに変更します。次に、マイクロピペットに一過性で穏やかな吸引を加えてメンブレンを破裂させ、良好な全細胞構成を作成します
   手記：スライスを記録チャンバーに移した後、スライス表面の破片を取り除くために、少なくとも5分間安定した灌流を確保します。健康なニューロンと不健康な/死んだニューロンを区別する能力は、良好なシーリングと安定した記録にとって最も重要であることは注目に値します。不健康な/死んだニューロンは、目に見える大きな核とともに腫れたり縮んだりした外観をしていますが、健康なニューロンは明るく滑らかな膜を持つ3次元(3D)形状を特徴とし、その核は見えません。全細胞構成を実現するには、必要に応じて高速または低速の静電容量を段階的に補償することが不可欠です。室温(RT)では、K⁺ベースの細胞内溶液とCs⁺ベースの細胞内溶液で、液路電位はそれぞれ15.1〜15.2ミリボルト(mV)と4.3〜4.4mVと計算されます。私たちの研究では、記録されたデータは液体接合電位について補正されませんでした。
8. 内因性膜特性の記録
   1. 発火特性の記録:RMPで一連の1秒の脱分極電流パルス(25〜150ピコアンペア(pA)と25pAの増分)を使用して、電流クランプ内の各ニューロンの発火パターンをテストします。オフラインでの単一作用電位の閾値、振幅、半値幅を測定します。

>表 1: ACSF のレシピ

の % 名 % 名 名 名 名 名 名 名 名

コンポーネント	分子量	濃度(mM)	g/L
NaCl	58.5	117	6.84
KClの	74.5	3.6	0.27
NaH2PO4・2H2O	156	1.2	0.19
CaCl2・2H2O	147	2.5	0.37
MgCl2・6H2O	203	1.2	0.24
NaHCO3	84	25	2.1
D-グルコース	180	11	1.98
アスコルビン酸	198円11銭	0.4	0.08
ピルビン酸ナトリウム	110	2	0.22

>表2:K⁺ベースの細胞内溶液のレシピ

の 名 % 名 名 銭

コンポーネント	分子量	濃度(mM)	mg/100mL
K-グルコン酸	234.2	130	3044.6
KClの	74.5	5	37円28銭
Na2-ホスホクレアチン	453.38	10	453.38
エグタ	380.35	0.5	2月19日
ヘープス	238.31	10	238.3
Mg-ATPの	507円18	4	202年9月
Li-GTPの	523.18	0.3	15.7

>表3:Cs⁺ベースの細胞内溶液のレシピ

の 名 名 銭 名 名 名 銭

コンポーネント	分子量	濃度(mM)	mg/100mL
CsMeSO4	228	92	2097年6月
セシCl	168円36	43	723.95
Na2-ホスホクレアチン	453.38	10	453.38
ティー・クラウ	165円71銭	5	82円86銭
エグタ	380.35	0.5	2月19日
ヘープス	238.31	10	238.3
Mg-ATPの	507円18	4	202年9月
Li-GTPの	523.18	0.3	15.7

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NaCl	シグマ	S7653	ACSFおよびPBSの調製に使用されます
KClの	シグマ	60130	ACSF、スクロース-ACSF、およびK+ベースの細胞内溶液の調製に使用されます
NaH2PO4・2H2O	シグマ	71500	ACSF、スクロース-ACSFおよびPBSの調製に使用されます
CaCl2・2H2O	シグマ	C5080	ACSFおよびスクロース-ACSFの調製に使用
MgCl2・6H2O	シグマ	M2670	ACSFおよびスクロース-ACSFの調製に使用
NaHCO3	シグマ	S5761	ACSFおよびスクロース-ACSFの調製に使用
D-グルコース	シグマ	G7021	ACSFの調製に使用
アスコルビン酸	シグマ	P5280	ACSFおよびスクロース-ACSFの調製に使用
ピルビン酸ナトリウム	シグマ	A7631 (英語	ACSFおよびスクロース-ACSFの調製に使用
蔗糖	シグマ	S7903	スクロース-ACSFの調製に使用
K-グルコン酸	和光	〒169-11835	K+ベースの細胞内溶液の調製に使用
Na2-ホスホクレアチン	シグマ	P1937	細胞内溶液の調製に使用
エグタ	シグマ	E3889	細胞内溶液の調製に使用
ヘープス	シグマ	H4034-J	細胞内溶液の調製に使用
Mg-ATPの	シグマ	A9187の	細胞内溶液の調製に使用
Li-GTPの	シグマ	G5884	細胞内溶液の調製に使用
CsMeSO4	シグマ	C1426	Cs+ベースの細胞内溶液の調製に使用
セシCl	シグマ	C3011	Cs+ベースの細胞内溶液の調製に使用
ティー・クラウ	シグマ	T2265	Cs+ベースの細胞内溶液の調製に使用
Na2HPO4	Hengxing化学試薬		PBSの調製に使用
ホウケイ酸ガラスキャピラリー	世界の精密機器	TW150F-4	外径1.5mm、内径1.12mm
マイクロピペットプーラー	サッターインストゥルメント	P-97	マイクロピペットの調製に使用
赤外線CCDカメラ	Dage-MIT	IR-1000
パッチクランプアンプ	ヘカ	EPC-10
マイクロマニピュレーター	サッターインストゥルメント	MP-285
X-Yステージ	バーリー	ジブラルタルX-Y
正立顕微鏡	オリンポス	BX51WI
浸透圧計	アドバンスド	フィスク210
PHメーター	メトラー・トレド	FE20

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