マルチシャンク線形シリコンプローブを用いた行動マウスの脳電気的活動の記録

要約

出典:Sauer, J., et al. Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、マルチシャンク線形シリコンプローブをマウスの脳に埋め込んで局所電界電位を測定するためのプロトコルの概要を示しています。この手順では、プローブを定位固定装置に固定し、標的の脳領域に正確に配置し、脳に挿入し、歯科用セメントで固定します。移植後、アセンブリはケーシングで保護されます。回復後、このセットアップにより、局所的な電界電位を記録することができ、ニューロンの活動に関する洞察が得られます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 事前準備

1. 注入プロセス中にシリコンプローブと電極コネクタを一時的に運ぶ適切な挿入ツールを設計および構築します。カスタムビルドの挿入ツールの例については、図 1 を参照してください。
2. シリコンプローブと電極コネクタを、セラミック先端の鉗子を使用してパッケージから慎重に取り出します。
3. コネクタボードを持ち上げ、スタンドに取り付けられたワニクランプでしっかりと固定します。
4. ステレオスコープを使用して、プローブをセラミック先端鉗子の挿入ツールに合わせます。焼灼器で溶かしたパラフィンワックスの~2 mmの層を塗布して、プローブを挿入ツールに接着します。この手順では、プローブシャンクに触れないように注意してください。
5. 電極コネクタを標準の粘着テープを使用して挿入工具のシャフトに固定します。メーカーによっては、埋め込み前にアース線を電極コネクタボードにはんだ付けする必要がある場合があります。ワニス絶縁銅線の短い2本から、はんだごて(400°C)でスズはんだを適用して絶縁体を剥がします。アース線を電極コネクタボードの適切なスロットにはんだ付けします。
6. さらに2本の銅線の絶縁体をはがします。各裸の銅線をステンレス鋼のネジ(直径1 mm、長さ2 mm)に3回巻き付けます。鋼のはんだ付けに適したフラックスを塗布し、銅線をスクリューキャップの底にはんだ付けします。ネジ山の下半分に錫はんだが付着していないことを確認してください。
7. 標準のマルチメータを使用して、ワイヤとネジの間の電気的接触を確認します。
8. シリコンプローブのシャンクとアースネジを70%エタノール(10秒)に浸して消毒します。
9. プラスチック製のパスツールピペットのヘッドを半分に切って、プローブインプラント用の保護カバーを準備します。

2. インプラント手術

1. 手術器具(はさみ、先端の細い鉗子、手術用クランプ)をホットビーズ滅菌器で滅菌します。70%エタノールですべての表面を拭きます。
2. ~1 L/分で供給される酸素中の 3% イソフルランで麻酔を誘発します。
   1. メンテナンスには、1〜1.5%のイソフルランを使用してください。外科的耐性を達成するために必要なイソフルラン濃度は、動物ごとに異なる可能性があることに注意してください。
   2. 安定した外科的耐性は、動物がつま先の挟み込みに反応しない場合に達成されます。マウスの呼吸数を監視し、必要に応じてイソフルランの濃度を調整します。
   3. 乾燥を防ぐために動物の目に軟膏を塗ります。
3. マウスを定位固定装置フレームに取り付け、イヤーバーを外耳道にそっと挿入します。マウスの頭がイヤーバーで安定したら、マウスピースを鼻の上に置いて、イソフルランを連続的に送達します。マウスをタオルまたはパッドの上に置き、ブプレノルフィンを皮下注射します(0.05〜0.1 mg / kg体重)術後鎮痛を確実にします。.
4. 標準的なシェーバーで頭を剃り、70%エタノールで皮膚を消毒します。手術用ハサミを使用して、頭蓋骨の正中線に沿って皮膚を切開し、外科用クランプを使用して皮膚を開きます。
5. 定位固定装置アライメントツールを使用して動物の頭を位置合わせし、ブレグマとラムダを水平にします。ブレグマとラムダの間の高さオフセットは50μm未満である必要があります。さらに、左右に定義された距離(たとえば、ブレグマの左右1 mm)で頭蓋骨表面のブレグマからの深さを測定することにより、中外側軸に沿って頭を水平にします。必要に応じてヘッドの傾きを調整します。
6. 3%過酸化水素で頭部を洗浄し、滅菌綿ワイプで拭いて乾かします。
7. 適切な定位固定アトラスを使用して、ブレグマに対する開頭術の位置を決定します。
8. 0.9 mmドリルヘッドを使用して、小脳の上の骨に2つのネジ穴を開けて、アースネジと基準ネジを配置します。さらに、インプラントを安定させるためには、ネジを固定するための1〜3個の穴が望ましいです。アンカースクリューの位置は、開頭術の位置によって異なります。海馬に移植するには、反対側の頭頂葉と同側の前頭皮質にアンカーネジを配置します。適切なドライバーを使用して、ネジを骨に挿入します。脳に侵入しないように注意してください。
9. 開頭術は、インプラント側の周りの長方形の領域でドリルで頭蓋骨をゆっくりと薄くすることにより、開頭術を行います。滅菌したリン酸緩衝液(PB)で骨を頻繁に湿らせます。残りの薄くなった頭蓋骨は、細い(27G)注射針とピンセットの助けを借りて、優しく穴を開けて取り除くことができます。
10. 細い(27G)注射針で硬膜を慎重に突き刺します。ピンセットで針の先を曲げて小さなフックを作り、硬膜を引っ張って取り外します。脳表面が乾燥するのを防ぐためにPBを塗布します。
11. 電極挿入ツールを定位固定装置ホルダーに取り付け、プローブをbregmaにゼロにし、プローブを開頭術上の定位固定装置座標に移動します。ゆっくりと脳の表面を貫通します。プローブシャフトが曲がっていないことを確認してください。血管からの移植は避けてください。
12. プローブを目的の深さ~200μm以上までゆっくりと下げます。シリコンプローブの開頭術とシャンクを滅菌したワセリンで覆い、保護します。デンタルセメントを塗布して、プローブの基部を頭蓋骨の固定ネジに固定します。
13. セメントを塗布した直後に、プローブをゆっくりと目標の深さまで動かします。セメントを塗布した後、最後の~200 μmを進めると、プローブの横方向の動きが減少し、標的領域の組織損傷が最小限に抑えられます。使用するセメントの硬化時間は、プロトコルのこのステップに影響を与える可能性があることに注意してください。セメントが急速に硬化するため、シリコンプローブの損傷を避けるために、このステップを省略し、プローブをターゲットの深さに直接埋め込みます。
14. セメントが硬化した後、ワックスを焼灼器で溶かして、プローブを挿入ツールから放出します。
15. コネクタボードを挿入装置から外し、ワニclを使用して頭蓋骨の適切な場所に配置しますamp 挿入ハンドルに取り付けられています。海馬にプローブを埋め込む場合は、コネクタボードを反対側の壁面骨に置きます。コネクタボードをデンタルセメントを使用して頭蓋骨に固定します。
16. コネクタボードのアース線と基準線を、小脳の上の2本のネジに取り付けられた線にはんだ付けします。
17. 保護カバーを正しい高さにトリミングし、シリコンプローブの上に置きます。露出した頭蓋骨の周りの皮膚を避けて、デンタルセメントを使用してカバーをコネクタボードと頭蓋骨に固定します。通常、移植部位の周りの皮膚を縫合する必要はありません。

3. 手術後の回復

1. 少なくとも2日間は適切な鎮痛治療を行います(例:. 日中は6時間ごとにブプレノルフィンを皮下注射し、24時間ごとにカルプロフェン(4〜5 mg / kg体重)と組み合わせて一晩飲料水に注射します。.インプラントの損傷を防ぐために、単一のハウジングが推奨されます。
2. 回復には少なくとも1週間かかります。地域の動物福祉ガイドラインに相談してください。

>4. データ取得

1. 整流子を介して接続された適切なデータ収集システムを使用して、自由に動くマウスからLFPを記録します。LFPを集録するには、1〜5kHzのサンプリング周波数を使用します。LFPとともに単一ユニットの放電を記録する場合は、より高いサンプリングレート(20〜30 kHz)が必要です。
2. オフライン分析のために、個々のチャンネルの生の記録ファイルを保存します。

結果

図1:挿入ツールの画像。シリコンプローブは、ワニクランプの基部に接着された昆虫ピンに取り付けられています。ホルダーのシャフトは、定位固定装置マイクロマニピュレーターに挿入して移植することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
スタンド付きワニクランプ	ライヒェルト・エレクトロニック	ホルターZD-10D
シリコンプローブ	ケンブリッジニューロテック	Pシリーズ32
実体鏡	オリンポス	SZ51
ワニス絶縁銅線	ビュルクリンエレクトロニック	89のF 232
アースネジ	Screws & More GmbH (screwsandmore.de)	DIN 84 A2 M1x2
上げ潮	スタノール	114018
セラミック先端鉗子	ファインサイエンスツール	11210-60
パラフィンワックス	シグマ・アルドリッチ	327204
焼灼器	ファインサイエンスツール	18010-00
半田鏝	クルツ・エルサ	OIC1300
エタノール	カール・ロス	9065.1
パスツールピペット	カール・ロス	EA65.1
熱滅菌器	ファインサイエンスツール	18000-45
脳定位固定装置用フレーム	デビッド・コップフ	モデル1900
脳定位固定装置用電極ホルダー	デビッド・コップフ	モデル1900
イソフルラン	アッヴィ	B506
酸素濃縮器	レスピロニクス	1020007
ブプレノルフィン	インディビオールUKリミテッド
電気シェーバー	トンデオ	エコXS
ヒーティングパッド	サーモラックス	463265/-67
サージカルクランプ	ファインサイエンスツール	18050-28
過酸化水素	シグマ・アルドリッチ	H1009
滅菌綿ワイプ	カール・ロス	EH12.1
ドリル	プロクソン	マイクロモット230 / E
21G注射針	B.ブラウン	4657527
リン酸緩衝液/リン酸緩衝生理食塩水
脳定位固定装置アトラス	エルゼビア	9.78E+12
手術用ハサミ	ファインサイエンスツール	14094-11
外科用鉗子	ファインサイエンスツール	11272から40
27G注射針	B.ブラウン	4657705
ワセリン
歯科用セメント	サンメディカル	スーパーボンドT&M
カルプロフェン	ゾエティス	リマジル50mg / ml
録音アンプ	インタンテクノロジーズ	C3323
USB取得ボード	インタンテクノロジーズ	C3004
録音ケーブル	インタンテクノロジーズ	C3216
電気整流子	ドーリックレンズ	HRJ-OE_FC_12_HARW