マウス網膜切片のニューロンにおける光誘発シナプス後応答

要約

出典:Hellmer, C. B., et al. Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques. J. Vis. Exp.(2015年)。

このビデオは、暗順応したマウス網膜組織スライス調製物における光誘発後シナプス応答の記録を示しています。網膜切片を記録室に入れ、記録ピペットを使用して網膜神経節細胞との電気的導通を確立する。光パルスを印加して神経節細胞に興奮性のシナプス後電位を生成し、ピペットで記録します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 実験液の準備

1. 実際の実験の1日前から1週間前に解剖液を調製します。網膜解剖には、低温での強力な緩衝能力16のために、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)緩衝液を使用してください。すべての化学物質を次のように混合します(mM単位):115 NaCl、2.5 KCl、2.5 CaCl₂、1.0 MgCl₂、10 HEPES、28グルコース。NaOHでpHを7.4に調整します。溶液を冷蔵庫で最大1週間保管してください。.
2. 記録液はエイムズの培地で、網膜製剤用に設計された人工脳脊髄液(aCSF)です。実験日までに、チューブ内のエイムズ粉末(500ml溶液で4.4g)を秤量します。また、_NaHCO3(500ml溶液で0.95g)を秤量し、エイムズ粉末と混合します。
3. 実験日までにパッチクランプ記録用の細胞内ピペット溶液を準備します。すべての化学物質を次のように混合します(mM):111 K-グルコン酸、1.0 CaCl₂、10 HEPES、1.1エチレングリコール四酢酸(EGTA)、10 NaCl、1.0 MgCl₂、5 ATP-Mg、および1.0 GTP-Na。KOHでpHを7.2に調整します。従来のシリンジフィルターでピペット溶液をろ過します。~500 μlのアリコートを作り、冷凍庫または冷凍庫で保存します。

>2. 実験当日の準備

1. 実験の前夜、マウスをケージ(C57BL/6Jまたは類似の背景、生後4〜8週齢、オス)の暗空間に置き、一晩(O / N)暗順応します。
2. 解剖の準備:
   1. ガラスビーカーに解剖液(100〜200ml)を入れ、氷の上に置き、酸素で少なくとも10分間泡立てます。
   2. 網膜製剤の保管のためにダークボックスの酸素化を開始します。
   3. 網膜スライス調製用のグリースレール付きのプラスチックカバースリップを準備し、それぞれを35mmのプラスチック皿に入れます。
   4. 新しいカミソリの刃をチョッパー(ティッシュスライサー)に取り付けます。
   5. フィルターメンブレンを半分に切ります。これは網膜スライス用です。
   6. 解剖ツールを位置合わせし、ピペットを解剖顕微鏡の近くに移します。作業領域は、暗闇でも各ツールに簡単にアクセスできるように、適切に整理されている必要があります。
3. パッチクランプ録音の準備:
   1. Amesの粉末とNaHCO₃を蒸留水(Ames 4.4 gおよびNaHCO₃ 0.95 g / 500 ml ddH₂O)に溶解します。エイムズ培地を混合酸素(95%_O2および5%_CO2)で少なくとも30分間泡立て、記録温度レベル(~35°C)まで加熱します。NaHCO₃でpHを7.4に調整しますが、バブリングのままです。
   2. 解剖中に内部ピペット溶液を解凍します。解凍後、細胞内染色のために0.01%スルホダミンBを添加します。

3. 網膜スライス調製からのパッチクランプ記録

1. 録音準備:
   1. 灌流チューブをエイムズの培地でプライミングします。チューブを充填するときは、すべての気泡を通過させます。
   2. プーラーでパッチクランプ記録ピペットを作ります。ピペットにピペット溶液を充填するには、ピペットの先端が戻ってくるまで、ピペットの裏側を1分間浸します。次に、マイクロピペットフィラーを使用してピペットの~1/3を充填します。各ピペットは湿らせたピペットボックスに保管してください。
   3. パッチクランプ記録用の機器(コンピューター、アンプ、電荷結合素子(CCD)カメラ、顕微鏡など)の電源を入れます。
2. 部屋の照明を消します。レチナールスライス調製物を赤外線ビューアを使用して顕微鏡ステージチャンバーに置きます。固定化した後、連続灌流を開始します。灌流温度を33〜37°Cに設定します。
3. CCDカメラでスライス面を観察する。ターゲット細胞タイプが存在するターゲット位置に注目します。パッチクランプ記録には、健康的に見える細胞を選択します(つまり、表面が滑らかで、細胞の形状が良好である必要があります)。
4. 記録ピペットをピペットホルダーに入れます。ピペットをスライス調製に進めます。スライス調製物(~2 mm上)に近づいたら、顕微鏡でピペットの先端を見つけます。ピペットチップが顕微鏡で見えるようになったら、チップをターゲットセルに向かって下に動かします。
5. アンプをセットします。ピペットを0 mV/0 pA(ゼロ調整)に調整し、~10 Hzで~5 mVの連続電気パルスを開始します。ピペットの抵抗を確認してください。理想的な抵抗は、ほとんどの網膜ニューロンで5〜10MΩです。
6. 先端から吹き出し始めます。マウスピースを使用するか、注射器を使用して、ピペットが浴液に浸したときに陽圧を加えます。先端がターゲットセルの表面に来るまで、内部溶液を連続的に吹き出します。
   1. 正圧が細胞表面に小さなくぼみを作るときは、先端を少し進めて吹き出を止めます。ピペットの抵抗を確認します。増加が続いている場合は、そのままにしておいて、>1GΩ(ギガシール)に達するまで抵抗を監視します。抵抗が自然に増加しない場合は、ギガシールになるまで静かに負圧をかけます。
7. ギガシールを達成した後、保持電位を-70mVに変更します。その後、負圧を断続的に加えて、ピペットチップ内のメンブレンを破裂させます。全セル構成の場合、ピペット抵抗は500MΩから1GΩの間になり、容量性電流が見られます。時々、自発的なシナプス後電流が観察されることがあります。
8. -80 mV から +40 mV までの電流-電圧 (I-V) 関係を記録します。細胞の種類に応じて、さまざまなタイプの電位依存性チャネルが活性化されます。
9. 光で誘発されたシナプス電流または電圧を記録します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マウス(28-60日齢、オス)	ジャクソン研究室	C57BL/6J株
エイムズのミディアムパウダー	シグマ	A1420	たいへん良い
赤外線ビューア	ナイトフクロウオプティクス	NOBG1	明るい景色を見せてくれます。小さな物体にピントを合わせることが課題です。
赤外線ポケットスコープ	B.E.マイヤーズ	OWL Gen 3 NVポケットスコープ	素晴らしい景色
引き手	サッター	P-1000	たいへん良い。一貫したサイズのピペットを作成します。
ダークボックス	ペリカン	ダークボックス	たいへん良い
パッチクランプシステム	サイエンティフィカ	スライススコープ2000	優れたセットアップ。ほとんどの主要コンポーネントが1つのパッケージに含まれています。マイクロマニピュレーターは優れています。
増幅器	分子デバイス	マルチクランプ 700B	優れた簡単な制御。
ソフトウェアのアクワイアリング	分子デバイス	pClampソフトウェア	優れた簡単な制御。
光源(LED)	クールLED	pE-2 4チャンネルシステム	たいへん良い
CCDカメラ	Qイメージング	レティーガ 2000	たいへん良い
ファラデーケージ	手作り

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