ミニブタの皮質電気生理学記録のための軟皮質電気皮質検査アレイの硬膜下移植

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 軟皮質電位検査(ECoG)アレイの外科的移植

1. 麻酔
   1. 前投薬:生後2〜6か月(5〜8 kg)でメスのゲッティンゲンミニブタ(n = 7)を分離し、一晩絶食します。.ミダゾラムを0.75 mg / kg、アトロピンを0.25 μg / kg、ハルドールを0.1 mg / kgの混合物を皮内に注射し、動物が鎮静するまで待ちます。.先に進む前に動物の体重を量ってください。
   2. 静脈内(IV)リードの取り付け:
      1. 動物を手術台の温熱パッドの上に置きます。動物にフェイスマスクを装着し、セボフルランを3%〜3.5%で使用して麻酔を誘発します。
      2. 心電図リードを腹部に、血中飽和度センサーを尾に、体温センサーを鼻孔に配置します。
      3. IVリードを耳の静脈に置き、生理食塩水で満たされた注射器を使用して血液へのアクセスを確認します。軟膏を使用して、目の水分が保たれていることを確認してください。
   3. 挿管:アトラクリウムを0.5 mg / kg、ケタミンを1 mg / kg、フェンタニルを1〜2 μg / kgでボーラスを注入します。挿管のために動物を仰向けにします。.4.5mmチューブを挿入します。
   4. 投薬:挿管後、セボフルラン麻酔を停止し、10 mg / kg / hのプロポフォール注入、2μg / kg / hのフェンタニル、0.2〜0.5 mg / kg / hのアトラクリウム、および4〜7 mg / kg / hの生理食塩水を設置します。1 g / kg / hでマンニトールの注入を開始して、手術中の脳の腫れを軽減します。
      注:マルチモーダル鎮痛レジメンは、地元の動物倫理委員会が推奨する場合に使用できます。
2. 無菌フィールドと皮膚の準備:手術野を超えて頭の表面全体を剃ります。滅菌パッドを使用して、ベタジンで頭を徹底的にこすります。次に、インスツルメンテーションテーブルと動物に滅菌ドレープを置き、手術窓のみを露出させます。最後に、ベタジンを使用した滅菌パッドで頭を再度こすります。
3. 開頭術と硬膜切開術
   1. スキンカット:正中線に沿ってメスナイフで皮膚を切開します。ラスパトリーを使用して、筋肉と骨膜(両側がブレグマから横方向に25 mm、ブレグマの前後に40 mm)を骨から分離し、スプレッダーを配置して、後でドリルするための最適なアクセスを確保します。
   2. 測定とマーキング:ブレグマとラムダを特定し、滅菌済みの手術用ペンでマーキングします(図1A、B)。滅菌定規を使用して、両半球の移植ターゲットを中心とした骨フラップの輪郭を定義します。この特定のケースでは、聴覚皮質が選択され、ブレグマから-5 mmから-15 mm、横方向に-4 mmから-20 mmの座標が選ばれました。次に、開頭術をインプラントと解剖学的ランドマークのサイズに調整し、開口部のサイズを制限します。
   3. 開頭術:
      1. 丸いカッティングビットを備えたボーンドリルを使用して、頭蓋骨の厚さを考慮して開頭術の輪郭をドリルします。骨が過熱しないように、生理食塩水で穴あけ位置を灌漑します。
      2. 硬膜に達するまで、輪郭を均一に慎重にドリルで穴を開けます。最初のブレークスルーで、アウトラインがほぼ突破できるほど薄くなるまで、アウトラインの穴あけを終了します。次に、平らなヘラ(正中線または外側)を使用して、開頭術の端を梃子にして骨フラップを1つに分解します。抵抗が大きすぎる場合は、骨を薄くし続けます。
      3. 骨片を滅菌生理食塩水に入れます。
      4. 骨フラップを取り外したら、鋭い骨のエッジが硬膜に食い込むのを防ぐために、ケリソンを使用して開頭術の端を慎重に削り取ります。
      5. 硬膜または骨に過度の出血が発生した場合は、それぞれGelfoamまたは骨ワックスを使用してください。開頭術に湿式湿布(滅菌生理食塩水の標準パッド)を置き、もう一方の半球でこの手順を繰り返します(図1B)。
   4. デュロトミー:
      1. 6-0縫合キットの針を使用して、開頭術の前端または後端の内側と外側の中間にある硬膜を慎重に突き刺して持ち上げ、スタブナイフで切開の始まりを作成します。
      2. 次に、皮質を保護するための切断ベースとして機能する硬膜下腔に挿入された小さな平らなヘラを使用して、両方のツールを同時に進めることにより、硬膜に前後のスリットを作成します。スリットがインプラントの幅よりわずかに大きいことを確認します(図1C)。このステップで出血や損傷が発生した場合は、ジェルフォームで覆い、止まるまで待ちます
         注:出血を避けるために、硬膜に大きな血管が存在する場合は、スリット軌道を適合させる必要があります。
4. 移植
   1. デバイスの挿入:
      1. インプラント(図2A)の両側に生理食塩水を使用してインプラントを洗浄し、硬膜下腔に滑り込みやすくします。インプラントを硬膜のスリットの上に置き、小さな鉗子を使用して、デバイスを各端に順番にスライドさせて硬膜下に挿入します。
      2. デバイスの台座の端を慎重に保持し、挿入を妨げる張力が発生しないようにインプラントで前進します。コネクタの端がスリットの上にある場合は、挿入を停止します。
   2. インプラントを固定する:インプラントを所定の位置に固定するには、開頭術の端の後または固定翼にチタンブリッジをケーブルに置き、適切なドライバーを使用して1本または2本のチタンネジで固定します(図1D)。
   3. アースの配置:アース線の絶縁体を1 cm慎重に取り外し、開頭術の後端(または目的の皮質または大きな血管から遠く離れた硬膜外の場所)に硬膜外に挿入します(図1Eのワイヤー)
   4. 反対側の半球で手順を繰り返します。
   5. 硬膜母傷の閉鎖: 3-0 吸収性縫合糸と小さなニードル ホルダーを使用して、インプラント ケーブルの周りで硬膜を慎重に縫合します。縫合線で薄い膜を引き裂かないように、2つの硬膜の端をできるだけ一緒にします(図1D、E)。
   6. 骨フラップの配置:チタン製のネジを使用して、各骨フラップの前部と後部にチタン製のブリッジを固定します。次のステップでフットプレートの脚の配置に関して、Tiブリッジの配置を計画するように注意する必要があります。チタンブリッジの端を頭蓋骨にねじ込みます(図1F、G)。
5. 台座とフットプレートの配置
   1. ポジショニング:この構成では、フットプレートにはそれぞれ2つのネジ穴が付いた6本の脚があります(図2B)。頭蓋骨へのフットプレートの配置を計画して、ネジの位置を最適化します(開頭術の端や側頭筋にフットプレートを配置しないでください)。脚をねじ込むことができない場合は、脚の穴をスキップしてください。
   2. フットプレートの固定:フットプレートのチタンネジをしっかりと固定するまでねじ込みます(図1Hを参照)。
   3. 台座の配置:接続ケーブルの上のチタン製のブリッジを取り外し、台座を裏返してフットプレートに着地します。台座をフットプレートにねじ込みます。台座がしっかりと固定されていることを確認します(図1I)。
6. 縫合糸と閉鎖
   1. 傷の洗浄:生理食塩水で洗い流すことにより、骨やその他の破片の皮下空間を洗浄します。台座の縁の周りの皮膚を切り取り、円柱に続く丸い縁を作成します。
   2. 皮下縫合糸:スプレッダーを取り外し、皮膚フラップを折りたたみます。4-0の非吸収性縫合糸ワイヤーを3mm間隔で使用し、シンプルな断続縫合糸または単純な連続縫合糸を使用して皮下縫合糸を作成します。台座から離れて、切開部の両側から台座に向かって移動します。
   3. 皮膚縫合糸:6-0非吸収性縫合糸を使用して、縫合糸を5mm間隔で皮膚に縫合します。台座から離れて、切開部の両側から台座に向かって移動します。ボイドを避けるために、2つの皮膚フラップ間と台座の端付近で良好な組織配置が得られるように注意してください(図1J)。
   4. 創傷被覆材:滅菌パッドとベタジンで創傷領域を再度清掃します。創傷に粘着性の滅菌包帯を貼ります。
7. 覚醒:すべての測定が行われた後、動物をすべての麻酔薬から外しますが、換気下に保ちます。鎮痛剤には、ブプレノルフィンパッチ(25 mg / h)を24時間塗布します。.ドレープで覆われた温熱パッドに動物を置き、起床時間を短縮します。自発呼吸が回復したら、動物を抜管し、意識が回復するまで酸素フェイスマスクの下に置きます(これには1〜4時間かかる場合があります)。
8. 術後の動物の世話:5日間、動物を綿密な監視下に置きます。セファレキシンを1日2回、他の動物から分離した食事と一緒に75mgの用量を与えます。浸した滅菌パッドで大量のベタジンを塗布することにより、毎日創傷の消毒を実施します(摂食中に行うのが最適です).
   手記：長期介護と住居:手術を受けた動物は24時間隔離されます。動物が仲間と社会的に交流できるほど元気であれば、元の社会集団に戻されます。台座と皮膚の開口部を毎日観察して、頭部へのデバイスの統合を追跡する必要があります。必要に応じて、台座の周りの場所を大量のベタジンで清掃します。

2. 電気生理学的記録

1. 自発的な活動:ワイヤレス録音システムを台座に差し込み、ベースラインアクティビティを2〜3分間記録します。これらの録音は、聴覚誘発電位を分析するためのコントロールとして機能します。
2. 聴覚誘発電位:ワイヤレスシステムに加えて、動物の耳の閉じたフィールドにスピーカーを挿入します。再生音バースト音響刺激は、さまざまな周波数(200〜20,000 Hzの範囲)で、約70 dBの音圧レベル(SPL)で120回の繰り返しで行います。次に、記録を平均化し、分析のために刺激期間にわたってそれらを整列させます。
3. 感覚誘発電位:針を鼻の3つの異なる位置に配置します。パルス発生器を異なる振幅で ~30 秒間鼻を刺激し、リクルートメント曲線を取得することにより、感覚電位を呼び起こします。

3. 自由に動く録音

1. セクション2で説明したのと同じ手順に従って、脳からの覚醒信号を記録します。実験者の腕に動物を抱きかかえるか、動物におやつを与えて気をそらすことで、ワイヤレスヘッドステージを接続します。動物の近くに設置された外部スピーカーを使用して音響刺激を提供します。

図1:脳へのソフトECoGの低侵襲移植。(A) 頭蓋骨への外科的アクセス、ブレグマの適応。(B)硬膜が見える両側開頭術。(C)最初の半球のスリット硬膜切開術。(D) 軟質 ECoG の硬膜下移植および硬膜閉鎖。(E)第2半球のスリット硬膜切開術。チタンブリッジを使用した最初の半球への骨フラップ固定。(F) 第 2 半球および硬膜閉鎖部へのソフト ECoG の移植。(G)第2半球での骨皮弁の固定。(H)頭蓋骨のフットプレートの位置。(I)フットプレートへの台座の固定。(J)台座ベース周りのスキンクロージャー。

図2:MRI対応台座。 (A)軟電極アレイにアクセスするための慢性MRI対応経皮接続システム(台座)。(B)頭蓋骨の固定のためにフットプレートに電極が取り付けられた台座。挿入図:フットプレートの詳細。