マウス海馬-内膜皮質スライスにおける局所電界電位の記録

要約

出典: Whitebirch, A. C. Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオは、マウスの海馬-嗅内皮質スライスの局所電界電位(LFP)を記録する手順を示しています。海馬のCA3橈骨層で電気刺激が与えられ、CA1錐体層のシナプス後電位に変化を引き起こします。CA1ニューロンの膜電位の複合変化(局所電界電位と呼ばれる)が記録されています。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 経心灌流

1. ショ糖切断液のリザーバーとして、容量60 mLのシリンジをベンチトップから約18インチ上に吊り下げます(たとえば、垂直ポストに3ピンスイベルクランプを使用します)。チューブをリザーバーの底に取り付け、チューブをローラークランプに通し、チューブのもう一方の端をきれいな20G針に接続します。
2. 60 mLのリザーバーに約30 mLの冷やしたショ糖溶液を入れ、カルボゲンラインをショ糖リザーバーに向け、灌流液を継続的に泡立てます
   手記：ショ糖がチューブと針を通って流れ、気泡が閉じ込められていないことを確認します。流量は、針から滴り落ちるスクロースの安定した継続的な流れを持つのに十分な速さである必要があります。
3. ブレンダーを使用して、凍結したスクロースを粉砕して氷のスラリーにブレンドし、大きなヘラ/スプーンを使用してスラリーを分配します。
   1. ガラスのペトリ皿の蓋の端に少量のショ糖スラリーを置きます。ペトリ皿の底に少量のショ糖スラリーを追加します。
   2. 約20〜30 mLのショ糖スラリーを灌流液リザーバーに加え、30 mLの冷やした液体スクロースとよく混合して、リザーバーに非常に冷たく、主に液体のスクロースと残りの凍結溶液の混合物が含まれるようにします。
4. マウスをイソフルラン気化器に接続されたチャンバーに入れます。酸素が約2 L / minで流れている状態で、気化器のダイヤルを回してイソフルランを5%濃度で供給し、タイマーを開始します.
   手記：スライスの過程を通してこのタイマーを動かし続けて、スライスがどれだけ速く取得されるかを測定します。この手順は、スライスが完了し、動物がイソフルランチャンバーに入ってから15〜20分以内に界面チャンバーで組織が回復するように、できるだけ早く行う必要があります。マウスを観察して、深い麻酔の状態が達成されていることを確認してください。最低5分後、マウスは深く麻酔をかけられ、つま先のつま先をつまむことに反応しなくなります。
5. マウスをイソフルランチャンバーから取り出す直前に、ペトリ皿の蓋に冷やしたショ糖溶液を約3〜5 mmの深さまで満たし、ペトリ皿の底を冷やしたスクロース溶液で約1.0 cmの深さまで満たします。
6. マウスを左の吸収パッドにすばやく移し、3枚のテープを使用して前肢と尾を固定します。切開を行う前に、マウスが反応しなくなることを確認するために、後肢のつま先をつまんでください。大きな組織鉗子と手術用ハサミを使用して、皮膚をテントで覆い、胸骨の下部から胸の上部まで縦方向に切開します。鉗子を使用して胸骨を引き上げ、はさみを使用して横隔膜を切り開きます.
   手記：マウスの初期位置決めと横隔膜を切断するための最初の数回の切開は、マウスが意識を取り戻さないように、できるだけ早く行う必要があります。処置全体を通して適切な麻酔深度を確保するために、マウスにノーズコーンを配置して、灌流中にイソフルランを送達することができます。
7. ハサミを使って両側の胸郭を切り込み、前肢が体と出会う点に向かって1回の大きな動きで切り込みます。鉗子で胸郭の前面を頭に向かって振り上げ、大きなハサミを使用して水平に切り込み、完全に取り外します。大きな鉗子を使用して心臓を所定の位置に保持し、20Gの灌流針を左心室に挿入します。針が正しく配置されると、冷やしたショ糖溶液が心室を満たすと、心臓の左側がすぐに青白くなります。
8. 小さなディセクターハサミを使用して右心房に切り込み、血液が循環器系から流れ出るようにします。切開が正しく行われれば、心臓への損傷は最小限に抑えられ、灌流中もポンプが続けられるはずです。
   手記：ロールアップしたティッシュペーパーを使用して、心臓から血液とスクロース溶液を吸い取り、処置中に灌流針の視認性を維持できます。
9. 灌流針が所定の位置に留まり、左心室から落ちないことを確認してください。適切な流量と配置により、肝臓は20〜30秒で淡い黄褐色/ベージュ色に青白くなります。
10. 30〜45秒後、大きなハサミを使用してマウスの首を切り落とします。頭を左手で持ち、頭蓋骨から皮膚を押したり剥がしたりします。よく灌流された動物では、頭蓋骨は非常に青白く、脳ははっきりと見える血管なしで頭蓋骨を通して非常に薄いピンク色(白に近づく)に見えるはずです。

2. 脳みそを取り出してスライス

1. 小さなボンのハサミを使用して、頭蓋骨の正面、目の近くにある正中線に向かって頭蓋骨を横方向に2回切り込みます。頭蓋骨の基部の両側にさらに2つの切り込みを入れます。
2. ヘッドをガラスのペトリ皿の底に移し、冷やしたショ糖溶液にほとんど浸します。小さなボンのハサミを使用して、頭蓋骨の長さに沿って正中線を切り取り、ハサミで引き上げて、下にある脳組織への損傷を最小限に抑えます。小さな組織鉗子を使用して、頭蓋骨の両側をしっかりとつかみ、本を開くように頭蓋骨を上に振り上げて脳から離します。
3. 左手の指を使って頭蓋骨のフラップを開いたままにし、マイクロスパチュラを嗅球近くの脳の下に挿入します。脳を頭蓋骨からショ糖に反転させ、マイクロスパチュラを使用して脳幹を切断します。脳を洗って、残っている血液、毛皮、またはその他の組織を取り除きます。
4. 大きなヘラ/スプーンを使用して、脳をガラスのペトリ皿の蓋に移します。両刃のカミソリの刃の残りの半分を前に脇に置いた状態で、最初に小脳を取り除き、次に嗅球を含む脳の最も前方の部分を取り除くために2つの冠状切開を行います(図1)。
5. 寒天ランプにシアノアクリレート接着剤を塗布します。大きな組織鉗子を使用して、脳を乾いた濾紙に非常に短時間置き、すぐにそれを寒天ランプに移し、脳の腹面を接着剤の上に置きます。
   手記：中間海馬のスライスの場合、脳は、前面が傾斜路の斜面を上向きにし、後部がブレードに近づくように向ける必要があります。腹側海馬のスライスの場合は、前端をスロープの斜面に向け、後端をスロープの上部に向け、ブレードからさらに離します。いずれの場合も、脳の冠状に切断された表面が寒天バッキングブロックに接触するように、脳をランプの上部に配置する必要があります(図1)。
6. 寒天と脳を入れたスライシングプラットフォームをミクロトームのスライシングチャンバーに入れ、冷やしたショ糖溶液に完全に浸します。大きなヘラ/スプーンを使用して、スクローススラリーをチャンバーに移し、かき混ぜて凍結したスクロースを溶かし、混合物の温度を~1〜2°Cに急速に下げます
   手記：スライス中の温度計を見てください。ショ糖溶液が3°C以上で温まる場合は、さらにスラリーを加えて混合し、温度を下げます。
7. ミクロトーム速度を0.07 mm/sに設定して、厚さ450 μmでスライスをカットします。各スライスが解放されたら、小さな組織鉗子と鋭利なメスを使用して、最初に2つの半球を分離し、次にスライスが主に海馬と海馬傍領域で構成されるまで組織を切り取ります(図1)。
8. プラスチック製の移送ピペットを使用して、スライスを個別に界面回収チャンバーに移し、スライスがACSFと空気の界面に配置され、スライスを覆う人工脳脊髄液(ACSF)の薄い半月板のみが覆われていることを確認します。チャンバーの蓋をしっかりと閉め、スライスを32°Cで30分間回復させます。
9. 32°Cでの初期回収後、界面回収チャンバーをウォーターバスから取り出し、マグネティックスターバーがチャンバー内のACSFの循環を促進するように低速に設定されたスターラーに置きます。スライスがさらに90分間回復するまで、室温まで徐々に冷まします。回収チャンバーがカルボゲンで絶えず泡立てられていることを確認し、大きな気泡がスライスの下に閉じ込められないようにします。

3. 自発的な活動の局所電界電位(LFP)記録を実行する

1. 集録ソフトウェアを実行しているコンピューター、コンピューターに接続されたモニター、刺激装置、マイクロマニピュレーター、温度コントローラー、顕微鏡光源、顕微鏡に取り付けられたカメラ、微小電極増幅器、デジタイザー、蠕動ポンプなど、必要なすべての機器の電源を入れて、LFP記録の準備をします。中央真空システムを使用している場合は、壁のバルブを開いて、記録チャンバーからACSFを除去する真空ラインを準備します。
2. 加熱されたリザーバーにACSFを満たし、チューブの一方の端をバブリングACSFを含む400mLビーカーに入れます。蠕動ポンプをオンにして、ACSFを400 mLビーカーから加熱されたリザーバーに向け、リザーバーから記録チャンバーに向けます。チューブを軽くたたいたりつまんだりして、閉じ込められた気泡を放出します。
3. ペリスタルティックポンプを調整して、記録チャンバーを通るACSFの流量が速い(~8–10 mL/分)ことを確認します。温度プローブを使用して、ACSFが記録チャンバーの中央で32°Cであることを確認します。
   手記：ACSFがペリスタルティックポンプを使用して記録チャンバーに送達されると、流量が高いと流量が大幅に変動する可能性があります。一貫した流量は、チューブに統合された一連の空のシリンジで構成される単純な脈動ダンパーを使用して達成できます(図2)。
4. 加熱されたフィラメントプーラーを使用して、ホウケイ酸ガラスキャピラリーからの刺激ピペットと記録ピペットを準備します。プーラープロトコルは、刺激または局所電界電位記録電極用の抵抗が2〜3 MOhmのピペットを生成するように構成する必要があります。
5. 刺激ピペットには1 M NaClを充填し、LFPピペットにはACSFを充填します。
6. チューブを短くクランプし、ポンプをオフにしてACSFの流れを一時停止します。細い鉗子を使用してスライスを記録チャンバーに移し、スライスが置かれているレンズペーパーの角をつかみます-スライスはレンズペーパーにくっつきます。レンズペーパーとスライスを下に向けて記録チャンバーにセットし、スライスを記録チャンバーに沈めたままレンズペーパーを「はがす」ようにします。harp.
   を使用してスライスを固定します 手記：ハープは、既製のものを購入することも、U字型のステンレス鋼またはプラチナと細いナイロンフィラメントを使用してラボで製造することもできます。
7. NaClを充填した刺激ピペットを手動マイクロマニピュレーターにセットし、ピペットの先端をスライスの表面(例えば、ラジアタム層内)まで約30〜45°の角度でゆっくりと進めます。ピペットの先端が組織に入ったら、ピペットをゆっくりと前方に進め、スライス内の軸索を不必要に損傷する可能性のある横方向または垂直方向の大きな動きは控えてください。ピペットの先端をスライスの少なくとも50〜100μmの深さに配置して、スライス中に損傷した表面近くの細胞を避けます。
8. ACSFを充填したLFPピペットを、電動マイクロマニピュレーターに取り付けられたピペットホルダーに入れます。口圧またはストップコックバルブを介して接続された1mLシリンジとピペットホルダーに短いチューブを使用して、非常に軽い陽圧を加えます><。 手記：目的の信号を記録するために、スライス内にLFPピペットを配置します:鋭い波紋の場合は、1つのLFPピペットをピラミッド層(SP)に、2つ目のピペットをラジアタム層(SR)に配置する必要があります。この構成により、SRの負の鋭波とSPの高周波リップル振動を同時に記録することができます(図3)。
9. マイクロマニピュレーターを使用して、LFPピペットの先端を約30〜45°の角度で関心領域(CA1錐体細胞層など)にゆっくりと進めます。ピペットの先端をスライスの少なくとも50〜100μmの深さに配置して、スライス中に損傷した表面近くの細胞を避けます。LFPピペットを前進させながら、アクイジションソフトウェアを使用して小さな電圧テストパルスを継続的に供給し、電極抵抗の急激な増加を監視します。これは、ピペットが詰まっているか、細胞に押し付けられていることを示している可能性があります。
10. LFPピペットが関心領域に配置されたら、ピペットホルダーに取り付けられたチューブのバルブを開いて、陽圧を慎重に解放します。
11. LFPを2番目の場所で同時に記録するには、2番目のピペットとマイクロマニピュレーターを使用して手順6.8〜6.10を繰り返します。
12. アクイジションソフトウェアのブリッジバランス機能を使用してピペットの直列抵抗を補正した後、電流クランプ構成で微小電極増幅器を使用して、局所電位の自発的な活動を記録します。自発的な鋭波リップル(SWR)は、SP層の細胞外電位に正のたわみとして現れます(図3)。
13. 誘発電位を記録するには、デジタイザに接続された刺激装置を使用して、NaCl充填刺激ピペットに短い(200μs)方形電圧パルスを送達します。刺激電圧ダイヤルを調整して、さまざまな応答振幅を呼び起こします。

結果

図1:水平角度の海馬-嗅内皮質(HEC)スライスの準備。(ア)(i)脳を摘出した後、カミソリの刃で2つの冠状切開を行い、脳の後部と前部を取り除きます。(ii)寒天ランプは、ミクロトームスライスプラットフォームに接着された2つの角度のある部分で構成されています。中間海馬のスライスを準備するには、前面が斜面を上向きにし、ランプの高いバッキング部分に接触するように、脳ブロックを寒天ランプに置きます。より腹側の海馬のスライスを準備するには、ブレインブロックを寒天ランプに置き、前面を斜面を下に向けて、後部の切断面がランプの高い裏側部分に接触するようにします。(iii)各スライスが解放されたら、メスでさらに数回カットを行い、半球を分離し、不要な組織を取り除きます。(

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
急性脳スライスインキュベーションホルダー	NIH 3Dプリントエクスチェンジ	3DPX-001623	ChiaMing Leeによって設計され、https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 で利用可能
アデノシン5 '-三リン酸マグネシウム塩	シグマ・アルドリッチ	A9187-500MG
Ag-Cl粉砕ペレット	ワーナー	64-1309、(E205)
寒天	ベクトン、ディキンソン	214530から500グラム
アスコルビン酸	アルファ・アエサル	36237
ビーカー(250mL)	キマックス	14000〜250
ビーカー(400mL)	キマックス	14000〜400
ビオシチン	シグマ・アルドリッチ	B4261
ミキサー	オスター	BRLY07-B00-NP0
ボンハサミ、小	ベクトン、ディキンソン	14184から09
フィラメント付きホウケイ酸ガラスキャピラリー(外径1.5mm、内径0.86mm、長さ10cm)	サッターインストゥルメント	BF150-86-10馬力	ファイヤーポリッシュキャピラリーが好ましい。
塩化カルシウム溶液(1M)	Gバイオサイエンス	R040
カメラ	オリンポス	オリ-150
圧縮カルボゲンガス(酸素95%/二酸化炭素5%)	エアガス	X02OX95C2003102
圧縮酸素	エアガス	オックス200
定電圧絶縁刺激装置	デジタイマー株式会社	DS2A-Mk.II
カバースリップ(22x50 mm)	VWRの	16004-314
シアノアクリレート系接着剤	クレイジーグルー	KG925	理想的には、精度のためにブラシオンフォームを使用してください
データ取得ソフトウェア	アクソグラフ	該当なし	同等のソフトウェア(pClampなど)は機能します。
Dell Precision T1500タワーワークステーションデスクトップ	谷間	該当なし	カタログ番号は特定のコンピューターによって異なります - 電気生理学取得ソフトウェアを実行できる限り、どのコンピューターでも機能します。
デジデータ 1440A	分子デバイス	1-2950-0367
デジタルタイマー	VWRの	62344から641	4チャンネルトレーサブルタイマ
使い捨て吸収剤パッド	VWRの	〒56616-018
ディセクタハサミ	ファインサイエンスツール	14082から09
両刃カミソリの刃	ペルソナ	BP9020
デュアル自動温度コントローラー	ワーナー・インストゥルメント・コーポレーション	TC-344Bの
デュアルサーフェスまたはラミナーフロー最適化記録チャンバー	該当なし	該当なし	このプロトコルで提示されるチャンバーはカスタムメイドです。商用の同等品は、ワーナーインストゥルメンツのRC-27Lです。
機器ラック	科学的な自動化	FR-EQ70インチ	ラックは厳密には必要ではありませんが、電気生理学を整理するのに役立ちます
エチレングリコール-ビス(2-アミノエチエーテル)-N、N、N'、N'-ティートラ酢酸(EGTA)	シグマ・アルドリッチ	324626から25GM
濾紙	ワットマン	1004 070
ファインスケール	メトラー・トレド	XS204DR
フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー	サッターインストゥルメント	P-97
ガラスシャーレ(100 x 15 mm)	コーニング	3160-101
グルコース	フィッシャーサイエンティフィック	D16-1
グアノシン5 '-三リン酸ナトリウム塩水和物	シグマ・アルドリッチ	G8877-250MGの
アイスバケツ	シグマ・アルドリッチ	BAM168072002-1EA
イソフルラン気化器	一般麻酔サービス	テック3
ラボ用テープ	フィッシャーサイエンティフィック	15-901-10R
レンズペーパー	フィッシャーサイエンティフィック	11〜996
光源	オリンポス	TH4-100
塩化マグネシウム溶液(1 M)	品質、生物学的	351-033-721EA
マグネティックスターバー	フィッシャーサイエンティフィック	14-513-56	カタログ番号は、攪拌子のサイズによって異なります。
マイクロマニピュレーター	ルイグス&ノイマン	SM-5
マイクロマニピュレーター(手動)	サイエンティフィカ	LBM-2000-00
顕微鏡	オリンポス	BX51WI
マイクロスパチュラ	ファインサイエンスツール	10089-11
モニター	谷間	2007FPb
MultiClamp 700B 微小電極増幅器	分子デバイス	マルチクランプ700B	MultiClamp 700Bには、ヘッドステージ、ピペットホルダー、モデルセルが含まれている必要があります。
N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)、(HEPES)	シグマ・アルドリッチ	H3375-25G(英語版)
針(20ゲージ、長さ1.5)	ベクトン、ディキンソン	305176
ナイロンフィラメント	YLIワンダーインビジブルスレッド	212-15-004	サイズ0.004。この猫。#は Amazon.com から
ナイロンメッシュ	ワーナー・インストゥルメンツ・コーポレーション	〒64-0198
パースタルティックポンプ	ハーバード大学装置	70-2027
ホスホクレアチンジ(トリス)塩	シグマ・アルドリッチ	P1937-1Gの
ピペットホルダー	分子デバイス	1-HL-U
プラチナワイヤー	ワールド精度	PT0203
ポリ乳酸(PLA)フィラメント	アルティメーカー	RAL9010
塩化カリウム	シグマ・アルドリッチ	P3911-500G
グルコン酸カリウム	シグマ・アルドリッチ	1550001から200MG
水酸化カリウム	シグマ・アルドリッチ	60377-1キロ
カミソリの刃	VWRの	55411-050
ローラークランプ	世界の精密機器	14041
規模	メトラー・トレド	PM2000
メスのハンドル	ファインサイエンスツール	10004-13
スライスハープ	ワーナー	SHD-26GH/2
炭酸水素ナトリウム	フィッシャーケミカル	S233-500
塩化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S9888-1KG
リン酸ナトリウム一塩基性無水物	フィッシャーケミカル	S369-500
ピルビン酸ナトリウム	フィッシャーケミカル	BP356-100
スパーテル	VWRの	82027-520
へら/スプーン、大	VWRの	470149から442
滅菌メスの刃	羽	72044から10
スターラー/ホットプレート	コーニング	〒6795-220
ストップコック・バルブ、一方向	世界の精密機器	14054
ストップコック・バルブ、3方向	世界の精密機器	14036
蔗糖	アクロスオーガニックス	AC177142500
スイベルクランプのサポート	フィッシャーサイエンティフィック	14-679Q
外科用ハサミ、鋭利/鈍器	ファインサイエンスツール	14001-12
シリンジ(1mL)	ベクトン、ディキンソン	309659
シリンジ(60 mL、Luer-Lokチップ付き)	ベクトン、ディキンソン	309653
3本ピン	フィッシャーサイエンティフィック	05-769-8Q
組織鉗子、大型	ファインサイエンスツール	11021-15
組織鉗子、小さい	ファインサイエンスツール	11023-10
トランスファーピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-711-7M
チューブ	タイゴン	E-3603	ID 1/16インチ、OD 3/16インチ
チューブ	タイゴン	R-3603	ID 1/8インチ、OD 1/4インチ
真空グリース	ダウコーニング	14-635-5D
振動ブレードミクロトーム	ライカ	VT1200S
ファラデーケージ付き防振テーブル	マイクロG / TMC-アメテック	2536-516-4-30PE
メスフラスコ (1 L)	キマックス	キム-28014-1000
メスフラスコ (2 L)	パイレックス	65640-2000
温水浴	VWRの	1209