マウス毛包における機械的に刺激された求心性出力と神経終末標識の複合記録

要約

出典:Bewick, G. et al., Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオは、マウスの耳介の毛包における機械的に刺激された求心性出力と神経終末標識の複合記録を示しています。蛍光膜色素への曝露前後の毛包神経終末の機械的刺激、生成された活動電位の電気生理学的記録、および毛包の神経終末標識の視覚化に関与するステップを概説します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 電気生理学的録音のセットアップ

1. マウスの外耳(耳介)の皮膚を、端の周りに細い昆虫ピン(耳あたり6~8本)がある記録室のPDMS裏地の基部に固定し、洗浄した神経を耳の付け根の2つの吸引電極の近くに配置します-1つは記録用(神経を取るため)もう1つは無関心電極(差動増幅器に中性信号を提供するため)。
2. 記録電極については、開口部の開口部と内径を2つの神経の厚さに慎重に一致させ、できるだけぴったりとフィットし、できるだけ長い長さになるようにします。
3. シリコンゴムチューブでもう一方の端に取り付けられた2mlの注射器から穏やかに吸引することにより、神経を電極に引き込みます。神経がまっすぐで、折りたたまれたり二重になっていないことを確認してください。
4. より強力な吸引を使用して結合組織または脂肪組織を引き込み、神経の周りの開口部をしっかりと密閉するプラグを形成することにより、高い電気抵抗/インピーダンスフィットを開発します。
5. 必要に応じて、もう一方の(無関心な)電極に吸引によって生理食塩水を満たします(毛細管現象によって充填されてもよい)。
6. 同一の記録線(銀またはプラチナ)を記録電極の内部穴に配置して、生理食塩水と電極の神経(記録)または電極の狭く、火で磨かれた端(無関心)に接触させます。各電極は、2芯シールドケーブルの異なるコアに個別にはんだ付けされています。バス(接地)電極(Ag/AgClペレット)をバスに入れ、記録電極に接続された2芯ケーブルのスクリーンに接地します。
7. 2つの電極からの電気的活動を差動アンプ、フィルタ(バンドパス0.2-2kHz)の別々のチャンネルに供給し、オシロスコープの画面に表示されます。チャンネルA(録音)とチャンネルB(無関心)の電気ノイズレベルが似ていることを確認します。この段階では、2つの電極のバランスがとれる前に、チャネルAの通常の自発的な活動電位を確認できない場合があります。
8. 電極間のバックグラウンドノイズの違いを補正するには、記録電極(チャンネルA)または無関心電極(チャンネルB)のインピーダンスを増加させます。これを行うには、乳輪(脂肪)結合組織を電極にさらに吸引するか、50mlシリンジに大きな吸引力を加えます。.
   1. この方法で「バランスが取れた」ら、ディファレンシャル(A-B)記録に切り替えて、トレース内または耳介の縁で毛を撫でるときに自発的な活動電位(AP)を探します。活動(スパイク)が見られない場合は、記録電極の神経と無関心電極の乳輪結合組織の密接な適合を再確認します-通常、シールがきつく(抵抗が高い)ほど、2つの電極のインピーダンスが等しいほど、より良いです。練習を重ねれば、これにより良質(>2:1)の信号:雑音比が達成されます。
9. コンピュータ上で動作するラボインターフェースと電気生理学ソフトウェアを介して心電図を記録します。スパイクのオーディオ出力は非常に便利で、オーディオアンプと関連するオーディオスピーカーを介してニューログラムを供給することで実現できます。しきい値をベースラインノイズのすぐ上になるように調整します(ホワイトノイズの「ヒスノイズ」がないことで識別されます)。
10. 薬物または蛍光スチリル色素が披針形終末にアクセスするようにするには、耳介縁近くの皮下脂肪層を慎重に剥がし、5~5 mm x 5 mmの窓を開き、真皮と卵胞の基部を露出させます(図1A、B)。
11. 脂肪でクリアされた耳の皮膚の~1 mmの折り目を前縁(該当する場合は、作成されたばかりのウィンドウのレベル)に固定し、適用された皮膚層の間に明確な生理食塩水で満たされた隙間を残します。折りたたまれた端に沿って突き出ている毛を、皮膚に触れずにピンまたは接地された細い鉗子で優しくなでて、オシロスコープの最大AP出力の領域とオーディオ出力の独特の「クリック」と「ポップ」を見つけます。

2. 刺激誘発活動電位の記録

1. 機械刺激プローブ(セラミック圧電アクチュエータに取り付けられたファイヤーポリッシュ仕上げの10cmホウケイ酸微小電極ガラス)を、動きが皮膚のひだと平行になるように配置します。先端を皮膚のひだから約0.5〜1 mmの位置に配置して、毛に触れますが皮膚には触れないようにします。プローブの先端を手動でゆっくりと動かして毛をそらし、スパイクを観察/聞くことにより、効果的な刺激を確認します。
2. ソフトウェアを使用して、1〜3本の髪の毛の機械的刺激を駆動し(例:5 Hz正弦波で3秒、10秒ごとにプローブ変位200〜500 μm)、神経で誘発された刺激応答を記録します。
3. 10秒間隔でいくつかの同一の機械的刺激列車を与えます。再現性のためにプローブの位置を最適化し、実験プロトコルに従って刺激の頻度を減らします(例:ドロップリピートレートを10秒から30秒
に)。
4. このソフトウェアを使用して、高周波ノイズ振幅の~2倍、最大APの~25%に設定された単純なしきい値を使用するなど、APのようなアクティビティを識別します。
5. しきい値を超えたAPを「イベント」としてカウントし、生成されたAPの頻度と特性を定量化します。

3. N-(3-トリエチルアンモニウムプロピル)-4-(4-(ジブチルアミノ)スティリル)ピリジニウムジブロマイド標識と組み合わせた刺激誘発発火の記録

1. 刺激誘発求心性発火および末端標識に対するスチリル色素の影響を調べるには、適切な濃度の任意のスチリル色素を入浴溶液に追加し、電気記録を続行します。
2. 必要な露光時間(通常は少なくとも30分)の後、卵胞を見るための準備を準備します。保持ピンを取り外して皮膚フラップを広げ、クリアされた真皮領域を露出させて端子ラベルを明らかにします。.
3. 無着色の生理食塩水で外部染料を洗い流し、生理食塩水を3回完全に交換します。
4. ガス化された色素を含まない生理食塩水の最終交換で10〜15分間インキュベートし、最も持続的な色素汚染が露出/外部膜から浸出できるようにします。
5. メンブレンに残っている非内在化色素を、生理食塩水中の隔離剤(スルホブチル化β-シクロデキストリン、1 mM、5分)で除去します。
6. 記録チャンバーを正立した落射蛍光顕微鏡のステージに移し、チャンバーをステージ/スライド移動機構にかみ合わせます。
7. スチリル色素に適した励起光で調製物を照らします。10倍または25倍の蛍光顕微鏡対物レンズを使用して、卵胞の標識を観察します(図1)。

結果

図1:電気生理学的記録配置とN-(3-トリエチルアンモニウムプロピル)-4-(4-(ジブチルアミノ)スティリル)二臭化ピリジニウムの標識毛包求心性披針形終末の標識(A)脂肪組織除去後の毛包の向き、神経の位置、記録電極、および卵胞神経支配の露出領域を示す電気生理学的実験用に設定された耳介調製物。(B)真皮まで覆っている脂肪組織から除去された領域に、明視野照明でいくつかの毛包が見えます。暗い、通常は二葉状の形は皮脂腺です。(C)B)の箱入り領域の拡大図は、スチリル染料N-(3-トリエチルアンモニウムプロピル)-4-(4-(ジブチルアミノ)スティリル)ピリジニウムジブロミドで標識され、落射蛍光顕微鏡による機械的刺激後に画像化された2つの披針形末端を示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PDMS - シルガード 184	ダウコーニング		柔軟性があり、不活性で、半透明の固体シリコーンポリマー。
No.3デュモン鉗子	ファインサイエンスツール	11231-20
Austerlitz昆虫ピン	ファインサイエンスツール	26002-10	ピンナ調製物をPDMSにしっかりと取り付けるための非常に細いピンで、損傷を最小限に抑えます。
AC差動プリアンプ	デジタイマー	ニューロログNL104A	入力される求心性電気ニューログラムのサイズを増幅します。差動記録により、外部の電気ノイズとベースラインドリフトが最小限に抑えられます。
ハイ/ローパスフィルター	デジタイマー	ニューロログNL125	シグナルコンディショニングは、外部の電気ノイズを低減して最適な信号対雑音比を確保します。
スパイクトリガー	デジタイマー	ニューロログNL201	イベント・ディテクタの閾値を設定し、オシロスコープに表示します。これは、活動電位検出の有効性を示しています。
オーディオアンプ&スピーカー	デジタイマー	ニューロログNL120S	感覚終末の電気発射の存在を補聴し、顕微鏡で機械的刺激の準備を調整するための有用なオーディオモニタリング
オシロスコープ	デジタイマー	PM3380A	この古いモデルを使用していますが、標準のオシロスコープで十分です。
ピエゾエレクトロセラミックウェーハ	Morgan Electroceramics、サウサンプトン、英国	PZT507	電気生理学/コンピュータインターフェース
ピエゾエレクトロセラミック電源	自家製		セラミックウェーハの変位を駆動する0-200V DC出力は、記録/刺激ソフトウェアとコンピューターインターフェースを介して出力の可変電子制御を備えています。Spike2ソフトウェアと1401microコンピューターインターフェースを使用しています。
電気生理学ソフトウェア	ケンブリッジ・エレクトロニック・デザイン(CED)	スパイク2 v7	電気生理学記録、刺激、データ分析ソフトウェア
研究室用インターフェース	ケンブリッジ・エレクトロニック・デザイン(CED)	1401マイクロ	アンプ/フィルターとコンピューター間の電気生理学インターフェース。それは心電図を入力し、また電気セラミック運動を駆動します。
FM1-43/シナプトグリーンC4	ビオチウム/ケンブリッジバイオサイエンス	BT70020	細胞膜の外皮に可逆的に仕切る蛍光膜プローブ。主に小胞膜のエンドサイトーシス/エキソサイトーシスのモニタリングに使用されます。
アドヴァセップ7	ビオチウム/ケンブリッジバイオサイエンス	BT70029	スルホン化b-シクロデキストリン誘導体は、露出した膜からFM1-43(およびその他のスチリルピリジニウム色素)をキレート化し、バックグラウンドラベリング/蛍光を下げることで内在化された色素をよりはっきりと見ることができます。
レティーガ エクシ ファスト 1394	Qイメージング		モノクロ冷却CCDカメラ - 基本モデル
Volocity 3D画像解析ソフトウェア	パーキン・エルマー	ボロシティ 6.3	画像キャプチャおよび分析ソフトウェア。