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サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. ショウジョウバエの幼虫の中枢神経系を解剖して準備
します
>注:幼虫の中枢神経系の解剖方法は、HaferとSchedlに明確に示されていますが、これらの以前に公開された方法は、スパイク周波数の測定に重要な下行ニューロンの長さを短縮します。ここでは、長く無傷の下行ニューロンを維持する幼虫の中枢神経系を切除するための追加の方法が概説されています。
- 生理食塩水の準備。
- 157 NaCl、3 KCl、2 CaCl2、4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES); pH を 7.25 に滴定する。
- 幼虫のショウジョウバエCNSを解剖します。
- 培養バイアルからさまよう3齢のショウジョウバエ・メラノガスターを同定して抽出し、200 μLの生理食塩水に入れます(図1A)。
- 一対の細い鉗子で口のフックをつかみ、2番目の鉗子のペアでウジの腹部をつかみます(図1B).
手記：腹部に圧力をかけすぎると、ウジの薄いクチクラ層が裂ける可能性があるため、圧力をかけすぎないでください。
- 口のフックと腹部をさまざまな方向にそっと引っ張って、ウジの尾側の端を頭の領域から分離し、ウジの内臓を露出させます(図1C).
手記：CNSは気管と消化管と絡み合っています。下行末梢神経の切断を防ぐために、CNSを組織から切断しないでください。
- 鉗子で消化管と気管からCNSを引き出します(図1D)。
- 必要に応じて、VannasスプリングハサミでCNS後部を脳葉に手動で横断することにより、血液脳関門を破壊します
手記：これは、使用されている化学物質の物理化学的特性に基づいて行う必要があります。図 2A の赤い線は、図 2B に示されている、推奨される切断点と、無傷の下行末梢神経幹を持つ交差した CNS です。トランスセッションされたCNSは、ステップ1.2.5の完了後、実験の準備が整います。
2. ショウジョウバエ中枢神経系の細胞外記録.
- CNSを録音用に準備します。
- ホウケイ酸ガラスキャピラリーからガラスピペット電極を5〜15mΩの抵抗まで引き抜きます。
- 切除したCNSを、200μLの生理食塩水が入ったワックスチャンバーに挿入します。clamp コーティングされていない昆虫ピンをワニ口クリップでアース線にはんだ付けし、ピンを生理食塩水に挿入して回路を完成させます。
- マイクロマニピュレータを使用して、電極をトランセクトされたCNSの尾側端に向けます。末梢神経幹に連絡する前に、取得/分析ソフトウェアで閾値レベルを調整することにより、バックグラウンドノイズの録音を排除します。
- シリンジにわずかな負圧を加えることにより、便利な末梢神経を吸引電極に引き込みます.
手記：ベースラインの発火頻度は、電極に引き込まれるニューロンの数と相関しており、ニューロンが多いほど電極の抵抗が増加することがよくあります。
- 中枢神経系の下行神経活動の細胞外記録を開始します。
- データ収集ソフトウェアで記録を開始し、ベースラインの発射頻度を監視します。ベースラインの発火率データを収集する前に、発火率を5分間平衡化させます。
- コントロール処理の発射パターンが図3A.
に示されているような破裂パターンでない場合は、準備と記録を破棄します。
手記：発火パターンの変化は、中枢パターンジェネレーターの異常または不安定な活動を示唆しており、神経機能を変化させる可能性があります。
- 5分後、200μLの生理食塩水+ビヒクルを加えて、チャンバーの総容積を400μLにし、制御発火率の記録を開始します。
- ベースラインが確立された後(3〜5分)、生理食塩水200μLを引き出し、生理食塩水に可溶化した実験剤200μLを追加します
手記：ジメチルスルホキシド(DMSO)は、親油性化合物の推奨溶媒であり、0.1% v/vを超えてはなりません。
- 薬物濃度を順次(低濃度から高濃度)で適用し、選択した期間(薬物の化学的特性に基づいて研究者が決定)各濃度を記録します。この薬物適用時点を取り込み/解析ソフトウェアにラベル付けするには、薬物と最終濃度を含むコメントを含めます。
手記：CNSの発火活性は、解剖後30〜50分後に約10〜20%低下するため、適切な未治療のコントロールを実施し、薬物治療はこの期間を超えないようにする必要があります。
