微小電極アレイを用いた脳切片における発作誘発性神経電気活動のモニタリング

要約

出典:Panuccio, G., et al.微小電極アレイに結合したげっ歯類の脳切片におけるてんかん様活動の記録と調節。J. Vis. Exp.(2018年)

このプロトコルは、発作誘発薬にさらされた脳スライスの電気的活動を記録するために微小電極アレイ(MEA)を使用することを含みます。この手順には、脳スライスをMEA記録チャンバーに配置すること、電気刺激を加えて人工発作を誘発すること、および結果として生じる信号を分析することが含まれます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. MEAセットアップの準備

>注:録音の15分前に開始してください。

1. 残りの容量の4AP-ACSF(4-アミノピリジン人工脳脊髄液)を500mLの三角フラスコに移します。
2. 三角フラスコをMEA(Microelectrode Arrays)アンプの上の棚に置き、チューブを使用して溶液が60mLシリンジに連続的に供給されるようにします。三角フラスコとシリンジの高さを調整して、重力供給速度を1 mL/分
   にします。 手記：正しい高さは、チューブの内径(ID)によって異なります。内径5/32インチのチューブの場合、30cmで十分です。
3. 4AP-ACSFを三角フラスコとシリンジで95%O₂/5%CO₂ガス混合物でバブリングします。
4. 4AP-ACSFを灌流チューブを通ってビーカーに流し、内部に空気が入らなくなるまで流し、溶液の流れを止めます。
5. MEAベースの発熱体をサーモスタットに接続します。ドライMEAチップをMEA内に置きます amplifierそして固定します amplifierヘッド。プラスチック製のパスツールピペットで、4AP-ACSFを記録チャンバーのインレットとアウターリザーバーに移送します。
6. 加熱カニューレを磁気ホルダーに固定し、その先端を記録チャンバーの入口ポートの内側に置きます。磁気ホルダーをMEAの磁気ストリップに取り付けます amplifierヘッド。灌流チューブをカニューレに接続します。カニューレをサーモスタットに接続します.
   手記：加熱カニューレは、記録チャンバーの入口ポートに到達し、金属材料による騒音を最小限に抑えるために、斜めのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)チューブで覆う必要があります。インレットリザーバーが4AP-ACSFで十分に満たされている場合、灌流システムから落下する液滴は見えません。
7. 吸引針をリザーバーの内側に置き、ACSF に沈めて負圧があることを確認します。低周波の吸引ノイズが一定でないか確認します。
   手記：吸引針は、4AP-ACSFが脳スライス表面のすぐ上を流れるように配置する必要があります。真空ラインまたは低騒音真空ポンプが使用できます。
8. 流量が1 mL/分になるようにフローレギュレーターを設定し、灌流を開始します。
   手記：重力供給灌流は、蠕動ポンプによって引き起こされる可能性のあるノイズを排除します。蠕動ポンプが望ましい場合は、低騒音モデルが必須です。
9. 4AP-ACSFがカニューレを通ったら、サーモスタットをオンにします。加熱カニューレを37°Cに、MEAベースを32°Cに設定して、記録チャンバー内の温度を32〜34°Cにします
   注:注意!溶液が入っていないカニューレを加熱しないと、不可逆的に損傷する可能性があります。カニューレの温度を記録温度(つまり、32〜34°C)よりも高く設定して、設定値と加熱カニューレの先端および記録チャンバー内の実際の値との間の固有の温度オフセットを考慮します。記録室の流量、環境温度、および容積はすべて、記録溶液の温度に影響を与えます。ステップ 1.9 で報告された設定は、説明されているプロトコルと機器に対して最適化されています。実際の記録温度は必ず熱電対で確認し、必要に応じて設定を調整してください。脳スライスの過熱を避けるために、MEAベースを34°C以上に加熱しないでください。
10. 外部参照電極を記録チャンバーインレットリザーバーに配置します.
    手記：MEAチップには内部参照電極が装備されていますが、カスタム記録チャンバーはこれをカバーしています。したがって、外部参照電極を使用する必要があります。飽和KCl(塩化カリウム)ペレットは、塩素処理を必要とせずに使用できるため、最も実用的です。

2. MEA ライブマッピング

1. 4AP-ACSFレベルと記録温度が必要に応じて安定したら、灌流ストップコックと吸引ストップコックをオフの位置に回して一時的に停止します。
   1. 倒立ガラス製パスツールピペットを使用して、1つの脳スライスをMEA記録チャンバーに素早く移します。必要に応じて、ファイヤーポリッシュでカールしたパスツールピペット(図1C)または柔らかくコンパクトなブラシを使用して、MEA記録エリアでの位置を調整します。ホールドダウンアンカー(図1D)をブレインスライスに置きます。灌流と吸引を再開するには、ストップコックをオンの位置に戻します.
      注:クリティカル!スライスを移し、60秒以内に灌流を再開しないと、組織が死滅する可能性があります。スライスホールドダウンアンカーは、表面張力の違いによりアンカーをブレインスライスに配置するときにブレインスライスが移動しないように、4AP-ACSFに保持する必要があります。脳のスライスをMEAに固定するためのアンカーは、ステンレス鋼線とナイロン糸(図1D)を使用してカスタムメイドすることも、市販のソースから入手することもできます。図1Eは、MEAチップをアンプのヘッドに接続した最終的な実験セットアップを示しています:記録チャンバー内のMEAチップ上に置かれた脳のスライスは、カスタムアンカーによって押さえられています。参照電極(赤丸)と加熱カニューレを覆うPTFEチューブ(赤矢印)は入口リザーバーに配置され、吸引針(青矢印)は出口リザーバーに配置されています。
2. 倒立顕微鏡ステージに取り付けられたカメラを使用して、脳のスライスを撮影します。
3. コンピュータソフトウェアでスクリプトmapMEAを実行して、電極をマッピングするためのGUIを起動します
   手記：カスタムメイドのソフトウェアにより、ユーザーは脳スライスの特定の構造に対応する電極を選択できます。このステップは、電気刺激を使用して正しい経路を活性化し、発作活性を抑制するために重要です。
4. [参照]ボタンをクリックして、脳のスライスの画像をロードします。参照電極がMEAの左半分の上段に表示されていることを確認します(図2A、三角形のマーク)。「Activate Pointer」ボタンをクリックし、アレイの左端の行で上部と下部の電極を選択して、画像の傾き補正と電極マッピングのXY座標をマークします。
5. スライス タイプのドロップダウン メニューから [Horizontal] を選択します。「デフォルトの構造」チェックボックスにチェックを入れます。
   手記：「新規構造を入力」ボタンを選択することで、構造をカスタマイズすることができます。水平ブレインスライスのデフォルト構造を図2Aに示します。
6. ブレインスライス画像の下にある番号付きのプッシュボタンを使用して、ROIに対応する電極を選択し、ストラクチャーパネルの対応するプッシュボタンをクリックして電極を割り当てます(図2B)。ROIごとにこの手順を繰り返します。
7. [保存]ボタンを押すと、ソフトウェアは、選択した電極とROIを報告するテーブルを含む#EXP_LabelledElectrodesという名前の結果フォルダを生成します。

>3. てんかん様活動の記録と電気的変調

1. 記録する前に、脳スライスが記録チャンバー内で5〜10分間安定するのを待ちます。
2. 刺激プロトコルの少なくとも10分前に刺激ユニットの電源を入れて、自己校正と安定化を可能にします。刺激制御ソフトウェアを起動し、刺激装置とMEAアンプが正しく接続されていることを確認します。これは、刺激制御ソフトウェアのメインパネルにある緑色のLEDで示されています。
3. バイポーラ構成で刺激を設定します。CA1/近位下細胞の錐体細胞層(cf.24,25)と接触している電極ペアを、スクリプトmapMEA(セクション12参照)でマッピングされた電極ペアの中から選択します。ワイヤーを使用して、選択した電極の1つを刺激装置のマイナスプラグに接続し、もう一方の電極を同じ刺激装置チャネルのプラスプラグに接続します。別のワイヤーを使用して、刺激装置のアースをのアースに接続します amplifier。
4. 録音ソフトウェアを起動します。データを取得するには、録音ソフトウェアのメインパネルにあるPLAYボタンを押します。少なくとも4回の発作性放電を記録します.
   手記：2kHzのサンプリング周波数により、ハードディスクのスペース使用量を最小限に抑えながら、公正な分解能で電界電位を取得できます。5 分間の録画ファイルには ~80 MB かかります。より高いサンプリング周波数が必要な場合があります。例えば、刺激アーチファクトやマルチユニットの活動を記録するためなどです。電界電位のみを観測するには、300 Hzのライブローパスフィルタを使用して、マルチユニットの活動を遮断します。
5. 刺激の強度を決定します。
   1. 刺激制御ソフトウェアでは、メインパネルを使用して、100μs/phase.
      の正方形二相性正負電流パルス持続時間を設計します。 注:注意!直流刺激には、機器の損傷を避けるためにバランスの取れた電荷パルスが必要です。
   2. 高速入出力(I/O)テストを実行して、最適な刺激強度を特定します。ステップ3.5.1で設計された刺激パルスを0.2Hz以下で送達するには、刺激制御ソフトウェアの適切な形式で5秒以上のパルス間間隔を追加します。パルス振幅タブで、初期パルス振幅を100μA/位相に入力し、刺激が海馬傍皮質で発作間欠性のようなイベントを確実に呼び起こすことができるまで、各試行で50〜100μAステップずつ増やします(記録ソフトウェアによって視覚化された信号を確認してください)。
6. 大脳辺縁系発作発生の電気的調節
7. 刺激ユニットをプログラムして、目的の刺激プロトコルを配信します。I/Oテスト中に特定された刺激振幅を使用します。
   手記： 誘発された応答の失敗率は≤20%であるべきです。
8. 刺激が停止した後、少なくとも 4 回の発作放電を記録して、刺激前の状態へのネットワークの回復を確認します (手順 3.4 を参照)。

結果

図1:このプロトコルに使用されるカスタム機器。 (A)4APでの回収、予備加温、および予備インキュベーション用の保持チャンバーは、ビーカーとペトリ皿を使用して組み立てられます。ペトリ皿はブレーカーよりも直径が小さく、シリンジプランジャーで所定の位置に保持する必要があります。ペトリ皿の底は、ペトリ皿の縁にシアノアクリレートで接着されたナイロンメッシュ(柔らかいストッキングから)に置き換えられています。酸素は、ペトリ皿の壁とビーカーの間に挿入された曲げられた脊椎針(22G)を介して供給されます。気泡はビーカーの側面から出てくる必要があり、脳のスライスの変位を避けるためにナイロンメッシュに到達しないでください。ペトリ皿の上部は、ACSFの蒸発を防ぎ、酸素飽和度を維持するための蓋として使用できます。(B)カスタム録音チャンバー。で:加熱...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ポリ-D-リジン	シグマアドリッチ	P7886	MEAコーティングに必要
NaCl	シグマアドリッチ	S9888	ケミカル
KClの	シグマアドリッチ	P9541	ケミカル
KH2PO4	シグマアドリッチ	795488	ケミカル
CaCl2*2 H2O	シグマアドリッチ	C3306	ケミカル
D-グルコース	シグマアドリッチ	RDD016	ケミカル
NaHCO3	シグマアドリッチ	S5761	ケミカル
MgCl2*6 H2O	シグマアドリッチ	M2670	ケミカル
MgSO4*6 H2O	シグマアドリッチ	M5921	ケミカル
蔗糖	シグマアドリッチ	RDD023	ケミカル
ピルビン酸、98%	シグマアドリッチ	107360	ケミカル
4-アミノピリジン	シグマアドリッチ	A78403の	けいれん薬
STG-2004	マルチチャンネルシステム	STG4004-1.6mA	電圧(±8 V)および電流出力(± 1.6 mA)を備えた4チャンネル刺激発生器
MEA1060	マルチチャンネルシステム	該当なし	MEAアンプ
平面MEA	マルチチャンネルシステム	60MEA500/30iR-Ti リング無	カスタム録音チャンバーを使用するには、リングがない場合があります
マックラック	マルチチャンネルシステム		録音ソフト
マックスティミュラスII	マルチチャンネルシステム		STG4004制御ソフトウェア
TC02	マルチチャンネルシステム	TC02	2チャンネルサーモスタット
PH01	マルチチャンネルシステム	PH01	加熱灌流カニューレ
時速	マルチチャンネルシステム	時速	PH01と吸引針用のマグネットホルダー
エラストチルE43	ワッカー	E43	カスタムレコーディングチャンバーをMEAに取り付けるために使用されるエラストマーシーラント
MEAカスタムチャンバー	クリセル楽器	SKEチャンバーMEA	カスタム録音チャンバー
Ag/AgCl電極、ペレット、1.0 mm	クリセル楽器	〒64-1309	カスタムレコーディングチャンバーの参照電極
テルガザイム	シグマアドリッチ	Z273287-1EA	酵素クリーナー
MATLAB	ザ・マスワークス		エレクトロデマッピングのプログラミング環境
VT1000S	ライカバイオシステムズ	VT1000S	ビブラトーム
	ワーナー・インストゥルメンツ	〒64-1309	Ag-AgCl電極ペレット1.0mm(E205)。参照電極。

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