嗅覚ニューロンの光遺伝学的刺激に対するショウジョウバエ幼虫のナビゲーション行動

要約

出典:Clark, D. A., et al. 嗅覚ニューロンの光遺伝学的刺激に応答したショウジョウバエ幼虫の行動の追跡。 (2018年)。

このビデオは、嗅覚ニューロン(ORN)の光遺伝学的刺激に応答したショウジョウバエの幼虫のナビゲーション行動の研究を示しています。ORNで光感受性イオンチャネルを発現するトランスジェニックショウジョウバエの幼虫は、行動領域内のアガロース上に配置されます。光による光遺伝学的刺激によりチャネルが開き、脳への信号伝達をトリガーする陽イオン流入を引き起こし、ナビゲーション行動が記録されます。

プロトコル

1. ビヘイビアアリーナの構築とビヘイビアアリーナでの光遺伝学的刺激を可能にするハードウェアの準備

1. 光を奪われた行動アリーナを構築するには、黒色のプレキシガラスアクリルシート(厚さ3 mm)で作られた89 x 61 x 66 cm³(35 "L x 24" W x 26 "H)の寸法のボックスを構築します(材料の表を参照)。そのような箱を作るための材料は、地元の金物店で入手できるはずです。このボックスをビヘイビアルームのテーブルトップに置きます(図1A)。
2. モノクロの USB (Universal Serial Bus) 3.0 CCD (Charge-Coupled Device) カメラに、赤外線 (IR) ロングパス 830 nm フィルターと 8 mm F1.4 C マウントレンズ (「資料の表」を参照) をブラックボックスの天井の中央に取り付けます。暗いアリーナで幼虫を照らすために、2つの赤外線発光ダイオード(LED)ストリップ(材料の表を参照)をテーブルトップに置きます(図1A)。
3. LEDプラットフォームを構築するには、22 cm×22 cm正方形のアルミニウムプレート(反射を排除するためにマットブラック仕上げでスプレー塗装することが望ましい)を入手します。プレートの中央に金属カッターを使用して、CCDカメラの周りに十分な大きさの穴を開けます。
4. 金属板を赤いLEDストリップライトで覆います(材料の表を参照)。LEDライトストリップワイヤを直列にはんだ付けし、ストリップワイヤをRaspberry Pi 2Bマイクロプロセッサ(材料表を参照)によって制御されるフォトカプラリレーに供給します(図1Bおよび2)。
5. フォトカプラーリレーをLEDストリップに接続する前に、Raspberry PiプロセッサにUbuntu Mate / Raspian Jesse / Linuxベースのオペレーティングシステムをインストールして構成します。LED ストリップとフォトカプラに電力を供給するための電源を接続します(図 2)(資料の表を参照)。CCDカメラの周囲にLEDプラットフォームを取り付けます(図1B).
   手記： Ubuntu Mate v16.04オペレーティングシステムは無料で利用できます。単純なPythonベースのコマンドのセットは、LED光刺激のプログラムパターンに簡単に適応させることができます(構文のファイルを参照)。
6. 行動領域のさまざまなポイントで均質な放射照度を確保します。分光計を使用してアリーナの表面の絶対放射照度を測定し、アリーナの表面全体で ~1.3 W/m² であると判断します。
   手記：この強度では、実験の過程で温度に大きな変化は観察されませんでした。別の研究では、~1.9 W/m² という高い放射照度を使用し、実験の過程で温度の変化は観察されませんでした。

2. 行動解析のためのショウジョウバエ幼虫の作製

1. 標準的なフライフード(材料の表を参照)のフライを25°C、相対湿度(RH)50〜60%、および12時間/12時間の明暗サイクルで維持します。
2. CsChrimsonを1対のORNで発現させるためには、UAS-IVS-CsChrimson系統の処女雌をOrX-Gal4系統の雄に交配します(「X」は、21対のORNのそれぞれで一意に発現する21の幼虫の匂い受容体(Or)遺伝子の1つに対応します)。
   1. あるいは、21の幼虫ORNすべてでCsChrimsonを発現させるために、UAS-IVS-CsChrimson系統の処女雌をOrco-Gal4系統の雄に交配します(「Orco」は21のORNすべてで発現する共受容体です)。
   2. これらの実験では、UAS-IVS-CsChrimsonライン単体をコントロールとして使用してください
      手記：ここにリストされているフライストックはすべて、ブルーミントンショウジョウバエストックセンターで入手できます(資料の表を参照)。
3. 交配中のオスとメスのハエが交配して48時間産卵したら、成虫を新鮮なバイアルに移します。
   1. 卵を含む食品バイアルの表面に、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した400μMのオールトランスレチナール(ATR)と蒸留水に溶解した89mMのスクロースを含む混合物を400μL加えます
      手記：少量のスクロースは、ATR溶液の幼虫の摂食を促進します。ATRは、CsChrimson発現のアップレギュレーションに必要な補因子です。ATRは光に敏感です。
   2. 卵を含む食品バイアルにATRを添加したら、バイアルを暗所でさらに72時間
      インキュベートします。 注:この研究と上記の2つの研究では、ATR摂食による幼虫の行動への影響は観察されていませんが、ATRを含まない上記の混合物と同量のテストラインにテストラインをさらすことにより、ATR摂食の影響を制御することをお勧めします。
4. ハエの餌の表面から3齢幼虫(産卵後~120時間)を高密度(15%)ショ糖溶液を用いて浮遊させて抽出します。P1000マイクロピペットを使用して、ショ糖溶液の表面に浮かんでいる幼虫を1000mLのガラスビーカーに分離します。
5. 毎回ガラスビーカーで800mLの新鮮な蒸留水を交換して、幼虫を3〜4回洗います。幼虫を行動アッセイにかける前に、幼虫を10分間休ませてください。

3. ビヘイビアアッセイ

1. ビヘイビアルーム内の温度(22〜25°C)と湿度(50〜60%RH)を一定に保ちます。
2. 22 cm x 22 cm四方のシャーレに150 mLの溶融アガロース(1.5%)を注ぎ、幼虫の這う培地を準備します。アッセイの各試行に対して、1つのシャーレが注がれ、実験ごとに8〜10回の試行が行われます。アガロースをペトリ皿で固化させ、1〜2時間冷却してから、挙動アッセイで使用します。​
   1. 準備した3齢幼虫のうち20個以下をペトリ皿の中心に移します(図1C)。ペトリ皿を蓋で覆います。CCDカメラの下のビヘイビアアリーナにペトリ皿を置きます.
      手記：実験にもよりますが、ビヘイビアアッセイは通常3〜5分間実施されます。アッセイで匂い物質を使用してガイダンスの手がかりを提供すると、結果として生じる匂い勾配は約5分間安定していることが観察されています。アッセイ時間が長いことは推奨されません。脱水症や長時間の 630 nm の赤色光曝露による幼虫への悪影響は、これらの時点では観察されていません。
3. 850 nmの赤外線LED光源をオンにして、ビデオ内の幼虫を視覚化します。CCDカメラを起動して、幼虫の動きを記録します。
4. Raspberry Piプロセッサに関連付けられたソフトウェアを使用して、赤色光刺激の適切なパターンを管理する手順をプログラムします。
   手記： 単純なPythonベースのコマンドのセットは、LED光刺激のプログラムパターンに簡単に適応させることができます(構文のファイルを参照)。

結果

図1:行動アリーナと幼虫の這う媒体。(A)ブラックボックスビヘイビアアリーナの正面図。アリーナの開いたドアからは、ボックスの天井から吊り下げられたCCDカメラが見えます。(B)CCDカメラの周囲には、光遺伝学的刺激に使用される赤色LEDライトストリップが組み込まれた金属製のプラットフォームの底面図。(C)アッセイに用いた幼虫の這う培地の上面図。幼虫の移動の記録を開始する前に、1.5% アガロースで層状にされた 22 cm x 22 cm のシャーレの中心に沿って、~20 匹の洗浄された幼虫を横たえます。幼虫の入ったシャーレは、アリーナの中央、CCDカメラの下、カメラの光源として使用される2つの赤外線LEDライトストリップの間に配置されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
幼虫の動きを捉えるビデオカメラ
CCDカメラ	エドモンド・オプティクス	106215
M52 - M55 フィルタースレッドアダプター	エドモンド・オプティクス	59から446
2インチイメージングレンズ用スクエアスレッドフィルターホルダー	エドモンド・オプティクス	59から445
RG-715、2インチ二角ロングパスフィルター	エドモンド・オプティクス	〒46-066
オプトジェネティックセットアップのためのエレクトロニクス
ラズベリーパイ2B	RASPBERRY-PI.org	RPI2-MODB-V1.2
3チャンネルプログラマブル電源	newegg.com	9SIA3C62037092
8チャンネルフォトカプラリレー	amazon.com	6454319
630nmクアッドローLEDストリップライト	environmentallights.com	赤3528-450リール
850nm LEDストリップ	environmentallights.com	wp-4000K-CC5050-60x2-キット
ソフトウェア
UbuntuのMATE v16.04	ヌウブントゥ	https://github.com/yslo/nubuntu
その他のアイテム
プレキシガラス、ブラックアクリル	ホームデポ	MC1184848BL
フライフードおよびその他の試薬
ニュートリフライフライフード	ジェネシー・サイエンティフィック	66〜112
アガロースパウダー	ジェネシー・サイエンティフィック	20〜102
22cm×22cm角のペトリ皿	VWR株式会社	25382-327
DMSOの	シグマ・アルドリッチ	D2650
蔗糖	シグマ・アルドリッチ	84097
すべての経網膜	シグマ・アルドリッチ	R2500
蠅
UAS-IVS-Csクリムゾン	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	55134
オルコ-ガル4	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	26818
OR42A-GAL4	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	9970
OR7A-ガル4	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	23907

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