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1. 光遺伝学によるノックダウンニューロンの標的刺激による無傷のニューロン回路におけるシナプス前タンパク質の役割の評価
>注:次のプロトコルでは、急性脳スライスでの電気生理学的記録の経験と電気生理学的セットアップへのアクセスが必要です。
- モザイク血清型1および2(rAAV1 / 2)の組換えアデノ随伴ウイルスを脳に定位的に注入します。マウスまたはラットの脳の定位アトラスを使用して、関心のある脳領域の定位座標を決定します。
- マイクロピペットプーラーを使用して、Ø 7–9 μm の長いシャンクの注入マイクロピペットを引っ張り、注入マイクロピペットをはさみでシャンクにクリップします。細いマーカーと方眼紙を使用して、2 mmごとに注入マイクロピペットにキャリブレーションマークを付けます。
- 動物をイソフルランで麻酔し、定位装置に固定します。
- 37°Cに設定された加熱パッドを使用して、操作中ずっと動物を暖かく保ちます。
- 眼用潤滑剤で目を保護します。
- 電気カミソリで頭の上の毛皮を剃ります。
- 坊主頭に綿棒を使ってポビドンヨウ素を塗ります。
- 解剖顕微鏡で、正中線を切開します。
- 綿棒で頭蓋骨の表面をきれいにして、ブレグマとラムダが見えるようにします。
- インジェクションマイクロピペットをホルダーに入れます。ホルダーを定位アームに取り付けます。
- ブレグマおよび/またはラムダに対する注入部位のx座標とy座標を決定します。
- ドリルを使用して、ターゲット領域の頭蓋骨を薄くします.
手記：穏やかな円を描く動きを使用し、頭蓋骨に穴を開けると脳の表面が損傷するため、避けてください。
- 出血がある場合はタオルペーパーで余分な血液を吸い取ります
手記：血液が多すぎると、z座標を正しく決定するのが難しくなります。
- キャピラリー作用により、≤2μLのウイルスを注射用マイクロピペットにロードします。
- 注射用マイクロピペットを注射部位のx座標とy座標に持って行きます。
- 硬膜からz座標を計算し、ピペットをゆっくりと脳に下げます。
- z座標に達したら、組織の調整を可能にするために3分待ちます。
- フレキシブルチューブを介して注射マイクロピペットの背面に接続された1mLシリンジを使用して、低陽圧を適用します。注射マイクロピペットから解剖顕微鏡を通じてウイルスの排出速度を視覚的に監視し、キャリブレーションマークを基準点として使用します
手記：ウイルスは、組織の損傷を避けるために、ゆっくりとした速度(<100 nL/分)で注入する必要があります。
- 注射が終了したら、ウイルスの逆流を避けるために、5分間待ってから、注射用マイクロピペットを0.2mm引き出し、さらに5分間待ちます。
- 注射マイクロピペットを脳からゆっくりと完全に引き出し、漂白剤で満たされた容器に廃棄します。
- 頭蓋骨を生理液で濡らし、3〜4針縫って皮膚を縫合します。
- 創傷にゲンタマイシン軟膏を塗布します。
- 動物を完全に回復するまで、フードペレットを入れた清潔なケージに入れ、ヒートランプの下に動物をシングルハウスします。
- 注射後≥15日後、深部イソフルラン麻酔下で動物の首を切る。
- ガス(95%O2、5%CO2)氷冷人工脳脊髄液(aCSF)溶液を使用して、ビブラトームで関心のある脳領域の急性脳スライスを調製します(mM):123 NaCl、1.25 KCl、1.25 KH2PO4、1.5 MgCl2、1 CaCl2、25 NaHCO3、2ピルビン酸ナトリウムおよび18グルコース(浸透圧は300 mOsmに調整)。例えば、CA3からCA1へのシナプス伝達を解析することが目的であれば、海馬形成の矢状スライス(厚さ350μm)を調製します
手記：このステップ以降は、環境光による光遺伝学的プローブの活性化を避けるために、暗い条件下で作業します。
- スライスを、脳スライスを保持するために設計されたチャンバー内の同じaCSFで37°Cで30分間回復させます。スライスは、記録まで同じ脳スライスチャンバーに室温で保管してください.
手記：これらの条件を使用すると、スライスを最大6〜8時間健康に保つことができます。
- 1つのスライスを水中の記録チャンバーに移し、回収に使用したのと同じaCSFを2 mL/minに1.5 mM CaCl2(合計Ca2+:2.5 mM)を添加し、ピルビン酸ナトリウムを含まない状態でスーパーフュージョンします
手記：スライスは、毒性を最小限に抑えるために、低濃度のCa2+(1 mM)で調製および維持されます。記録は、小胞の放出を促進するために2.5 mM Ca2+で行われます。
- 発現した蛍光レポーターのシグナルを簡単に確認します(例:TdTomato;図1B)を使用して、感染の局在と強度を確認します。
- 110 K-グルコン酸、22 KCl、5 NaCl、0.5 エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N、N、N'、N'-四酢酸(EGTA)、3 MgCl2,4 アデノシン 5′-三リン酸マグネシウム塩(Mg-ATP)、0.5 グアノシン 5'-三リン酸三ナトリウム塩(Na3-GTP)、20 K2 を含む細胞内溶液をパッチ電極に充填します。-クレアチンリン酸、10 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液をKOH(HEPES-KOH、pH 7.28、290mΩ)で調整
手記：ピペット抵抗が5〜6mΩのパッチ電極を使用してください。
- 赤外線照射下で、感染したニューロンからシナプス入力を受け取るニューロンから全細胞構成をしっかりとシールします。例えば、CA3錐体ニューロンが感染した場合、CA1領域の近位から内側の路にある錐体ニューロンにパッチを当てます(図1C).
手記：直列抵抗は補償せずに残すことができますが、一定で低くする必要があります(≤20MΩ)。
- 薬理学を使用して、調査中のシナプス電流を分離します。例えば、興奮性シナプス伝達を調査する目的であれば、10μMのビキュクリンで抑制性シナプス伝達をブロックします。
- 感染したニューロンの体性に配置された光ファイバー(Ø ≤250 μm)に結合された473 nmの青色レーザーを使用して、興奮性シナプス後電流(EPSC)などのシナプス電流を誘発します(例:250 μm)。CA3 錐体ニューロン)。
- 刺激の長さを最小限に調整して、光パルスごとに複数の活動電位を誘発する可能性を減らします。ChETAを使用する場合は、2ミリ秒に設定します。
- レーザーの刺激強度を調整して、小さいながらもはっきりと検出可能なシナプス電流(CA3とCA1の錐体ニューロン間の-70mVの保持電位で記録されたEPSCの≤50pAピーク振幅)を生成します。図1D)。ChETAと直径250μmの光ファイバーを使用する場合、ファイバー出口での刺激強度は1〜3mWが適切です
注意: レーザー強度を調整できない場合は、減光フィルターを使用してください。
- 473 nmのレーザー光線を感染したニューロンの体性に当てますが、軸索には当てません。たとえば、軸索の直接的な脱分極を避けるために、CA3体細胞に光を当て、Schafferの側副血球から遠ざけます。
- ナトリウムチャネルのブロッカーであるテトロドトキシン(TTX;0.5μM)をサンプルに塗布し、チャネルが活動電位駆動であることを確認します。
- さまざまな録音で、調査中のシナプス電流に選択的ブロッカーを適用して、刺激が選択的であることを確認します。
手記：例えば、2,3-ジオキソ-6-ニトロ-7-スルファモイル-ベンゾ[f]キノキサリン(NBQX、10 μM)をα-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸(AMPA)型グルタミン酸受容体媒介性EPSCに適用します。
- 反復刺激(≤20Hzで≥2刺激)に応答して、同じ急性脳スライス内の光学的および電気的に誘発されるシナプス電流を比較します。制御マイクロRNA(miR)を使用すると、電気刺激と光刺激の間で同様の程度のシナプス促進または抑制が観察されるはずであり、したがって、2種類の刺激によって同様の細胞メカニズムが活性化されることを示唆しています
手記：上記の手順は、光刺激がシナプス前ボタンの直接的な脱分極を誘発せず、したがってシナプス伝達のいくつかのメカニズムをバイパスしないようにするために必要です。
