長期インキュベーション後のマウス脳スライスの神経活動の測定

要約

出典: Cameron, M. A., et al., Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. J. Vis. Exp. (120)、(2017年)

このビデオでは、カルシウムイメージングと電気生理学的記録を使用して、マウスの脳スライスのニューロン活動を測定する技術を示しています。この方法では、組織にカリウムイオンを灌流し、細胞内のカルシウム変化を高速デジタルイメージングで記録することで、神経細胞の応答をリアルタイムに明らかにします。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. カルシウム染料のローディング

1. カルシウム色素は、個々の研究者の好みに基づいて選択してください。ここでは、Fluo-8AMまたはFluo-4AMを使用します。しかし、この方法は他の色素にも適用できます:DMSO中のカルシウム色素を1 mM溶液および1%ブロック共重合体(プルロン酸-127など)に溶解し、最終容量50 μLまで溶解し、10分間超音波処理します。
2. 最終濃度10 μM、0.01%ブロック共重合体を脳スライス用にaCSFに溶液を添加します。
   1. 成体動物の場合(>12週間)、色素(50μL)を直接脳切片にピペットで移し、75分間保持して、色素が深層に浸透しやすくします。
   2. 色素インキュベーション中に水中スライスの適切な酸素化を確保するために、2.5mLのaCSFで希釈したカルシウム染料を充填した密閉蓋(直径2.5cm、高さ3.5cmの円形ジャー)を備えたガラスローディングチャンバーを調製します。95% O₂/5% CO₂ で連続的に酸素化します。泡立たないでください。
3. 色素をロードした後、組織をaCSFで洗浄し、インキュベーションシステムに移し、実験に使用する準備ができるまで温度をゆっくりと15〜16°Cに下げます。

2. 電気生理学的記録とイメージング

1. 顕微鏡下の水中記録チャンバーに組織を置き、室温(~22°C)または生理学的温度(~35°C)のいずれかで4〜5mL/minの流速で酸素化aCSFを灌流します。U字型の金またはプラチナワイヤーにナイロンまたは金の糸を伸ばして接着したカスタムメイドの「ハープ」を使用して、ティッシュを所定の位置に保持します。
2. 電気生理学の場合:
   1. マイクロピペットプーラーを使用して1.5 mm(内径1.19 mm)のホウケイ酸ガラスから記録ピペットを調製し、5〜6 MΩの最終抵抗を達成します。
   2. ピペットに3〜4μLの内部溶液を入れ、CCDカメラを使用して赤外線微分干渉コントラスト(IR-DIC)下で細胞を可視化します。細胞内溶液は、実験結果を達成するために、各実験に合わせて慎重に調整する必要があります。
   3. マイクロマニピュレータを使用して、ピペットホルダーの吸引ポートからプラスの圧力を細胞の膜に加えられたままピペットを配置します。ILMが網膜から除去されているため、事前の膜掻き取りは必要ありません。ピペットをセルに取り付けたら、ピペットに穏やかな負圧を加えてギガオームシールを実現します。次に、短時間の負圧で細胞膜を破裂させます。
   4. 全セル電流クランプまたは電圧クランプ記録は、必要に応じて標準的な手法を使用して行います。
3. カルシウムイメージング:
   1. Fluo-4の単一励起波長の場合、励起光を460〜490 nmのバンドパスフィルターでフィルタリングし、放出された光を515〜550 nmのバンドパスフィルターでろ過します。高速デジタルカメラを使用して、最速かつ最も感度の高い録音を行います。必要に応じて画像を取得します。
   2. 蛍光の変化を時間の関数として測定します (Fluo-4) のいずれかで
   。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化ナトリウム	シグマ アルドリッチ VETEC	V800372
塩化カリウム	シグマ・アルドリッチ	P9333型
D-グルコース	シグマ・アルドリッチ	G5767
炭酸水素ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S6014
リン酸ナトリウム一塩基性	シグマ・アルドリッチ	S2554
塩化マグネシウム	シグマ・アルドリッチ	M9272
塩化カルシウム	シグマ・アルドリッチ	223506
ジメチルスルホキシド無水物	シグマ・アルドリッチ	276855
プルロニックF-127低UV吸光度*	ライフテクノロジー	P-6867	DMSO中の20%溶液
フルオ-4 AM	ライフテクノロジー	F23917
フルオ-8 AM	アブカム	AB142773
固定ステージ正立顕微鏡	オリンポス	BX51WI
顕微鏡対物レンズ	オリンポス	XLUMPlanFLN 20倍/1.00ワット	20倍
顕微鏡対物レンズ	オリンポス	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60倍
CCDカメラ	アンドール	イクソン +
パッチクランプアンプ	分子デバイス	マルチクランプ 700B
データ取得システム	分子デバイス	デジデータ 1440A	Axon Digidata®システム
ホウケイ酸ガラスキャピラリー	サッターインストゥルメント株式会社	BF150-86から10
微小電極プーラー	サッターインストゥルメント株式会社	P-97	フレーミング/ブラウンタイプマイクロピペットプーラー
記録・灌流チャンバー	ワーナー・インストゥルメンツ	RC-40LPシリーズ	ロープロファイルオープンバスチャンバー
ソフトウェア	分子デバイス	pクランプ 10.2
Andor iQ ライブセルイメージングソフトウェア	アンドール	アンドール iQ3
温度コントローラー	TE の技術	TC-36-25 RS232