テトロドトキシンおよびテトロドトキシン耐性ナトリウムチャネルを用いたモノシナプス結合の試験

要約

出典:Zhang, X. et al., Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオは、トランスジェニックフライを使用したモノシナプス結合のテストを示しています。このハエは、シナプス前ニューロンにテトロドトキシン耐性ナトリウムチャネルと赤色光活性化チャネルを持っており、これらは光遺伝学的に興奮してシナプス後ニューロンにシグナルを伝達します。

プロトコル

1. ハエの準備とGAL4プロモーター系統の同定

1. GAL4プロモーター系統を選択し、UAS-NaChBac導入遺伝子と活性化のための光遺伝学的導入遺伝子の両方を持つハエと交差させます
   手記：UAS-CsChrimsonは、その高いコンダクタンスと、テトロドトキシン(TTX)耐性ナトリウムチャネル(NaChBac)を介した活動電位を活性化しやすいため、選択されています。UAS-NaChBacとUAS-CsChrimsonはどちらもBloomington Stocks Repositoryから入手できます。
2. エタノール(35 mM)のストック溶液として全トランスレチナールを調製し、溶液を-20°Cの冷凍庫で保存します。
3. このストック28μLを約5 mLの再水和ポテトフレークフードに混合し、この混合物を従来のショウジョウバエ培地のバイアルの上部に加えます。
4. 0.2 mM all-trans-retinal を含む食品で csChrimson を発現する成虫のハエを 1 〜 3 日間飼育します。

2. TTXストックを用意する

1. 蒸留水または脱イオン水に1 mM TTXのストック溶液を作成します。この溶液は、ラボの冷蔵庫で数ヶ月間保管してください。TTXは危険物または規制物質として分類されている機関が多いため、TTXの保管に関する機関の方針を確認してください。

3. 電気生理学のためのハエの準備

1. オールトランスレチナールを含む食品で育てられた生後1〜3日の成虫ハエを収集します。
2. ハエをガラスのシンチレーションバイアルに入れます。バイアルを氷の上に1分間置き、ハエを固定します。
3. 粗い鉗子を使用して、カスタムメイドの記録チャンバーにフライを挿入します。チャンバーは、1/16インチアクリルからカットされた3 1/2インチサークルレーザーで構成されています。中央に3/4インチの穴を開け、カスタムホイルを2液性エポキシで取り付けます。ホイルには、フライが挿入される三角形の希望が入っています。
4. ワックスまたは紫外線(UV)硬化型エポキシを動物の周囲に塗布して、記録チャンバー内にしっかりと固定します。
5. グースネック光ファイバーで調製物を照らし、実体顕微鏡で可視化します。グースネックファイバーを斜め照明用に設定します。フライを側面から直接照らすように調整します。
6. 光のレベルを可能な限り低い設定に調整すると、フライがはっきりと視覚化できます。この光強度は個々の実験によって異なります
   手記：このプロトコルは、in situ脳外植片法を使用して適応させることができます。
7. 外部記録生理食塩水を取得します。生理食塩水には、103塩化ナトリウム、NaCl、3塩化カリウム、KCl、5 N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタン-スルホン酸、8トレハロース、10グルコース、26重炭酸ナトリウム、NaHCO₃、1リン酸二水素ナトリウム、NaH₂PO₄、1.5塩化カルシウム、CaCl₂、および4塩化マグネシウム、MgCl₂(270〜275mΩに調整)が含まれています。生理食塩水は95%O₂/5%CO₂(カルボゲン)で泡立ち、pHは7.3に調整されています。
8. 細胞外記録生理食塩水を4〜6滴ハエの準備の上に置きます。この時点で、解剖顕微鏡の光量を増やして視認性を高めます。
9. 電気分解を使用してタングステンワイヤーを研ぎます。ワイヤーを作成するには、硝酸カリウムの飽和溶液であるKNO₃を準備し、ワイヤーの先端を溶液に20回、それぞれ100msずつ浸しながら、先端が鋭くなるまで約20Vの交流(AC)を印加します。鋭利なタングステンワイヤーを使用して、ハエの頭のキューティクルを取り除き、脳を露出させます。
10. さらに、脳を取り囲む気管や脂肪体を取り除き、脳を露出させます。アンテナローブにアクセスする場合は、曲げたタングステンワイヤーまたは同様のツールを使用して、アンテナをホイル記録チャンバーの下にそっと押し込み、視認性を高めます。鋭利な鉗子を使用して、録音が行われる対象領域を覆っているグリア被覆をそっと引き裂きます。
11. 記録チャンバーを電気生理学装置に移します。脳を保存するために、カルボゲンで泡立った外部記録生理食塩水ですぐに灌流を開始します。生理食塩水リザーバーは顕微鏡ステージの上に配置され、調製物に重力で供給されます。真空ラインと2Lの三角フラスコを使用して、廃塩水を回収します。

4. 全細胞記録の取得

1. 市販のピペットプーラーでパッチピペットを引っ張ります。チップ抵抗が7mΩに近い適切なピペットを実現するための設定については、マニュアルを参照してください。
2. 4 μLの内部記録溶液をパッチピペットに加えます。内部生理食塩水は、アスパラギン酸カリウム140個、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸(HEPES)、アデノシン三リン酸マグネシウム4個(MgATP)、0.5グアノシン5'-三リン酸三ナトリウム塩水和物(Na₃GTP)、エチレングリコール四酢酸1個(EGTA)、および塩化カリウム1個(KCl)で構成されていますmM単位。
3. 全細胞記録用のパッチクランプアンプをセットアップします。アンプのオフセットをゼロにし、テストパルスを供給するようにアンプを設定します。ここでは、AMシステムズのパッチクランプアンプ2,400を使用しています。
4. ピペットを通して陽圧を加え、細胞に近づきます。マイクロマニピュレーターを使用してピペットを方向付け、細胞に接触させます。正圧を解放します。メンブレンの保持電位を-60mVに設定します。ピペットは、サブピコアンプの保持電流が低いことからも明らかなように、細胞の膜とギガオームのシールを形成する必要があります。
   手記：緑色蛍光タンパク質(GFP)誘導細胞ターゲティングを使用する場合は、ChR2の活性化とシナプス抑制の可能性を防ぐために、エピ蛍光光の使用を最小限に抑えるようにしてください。また、数分待ってから手順5を適用します。
5. -50mVから-60mVまでのテストパルスを供給するようにアンプを設定します。この設定は、パッチクランプアンプに標準装備されています。テストパルスにより、パッチピペットの充電に必要な電流を表す大きな静電容量式過渡電流が明らかになります。AM2400または同様のアンプの容量補償ノブを調整して、容量性トランジェントを削除します。
6. 負圧の短いパルスを印加して細胞膜を破裂させ、全細胞形状を得る。
   手記：ニューロンの静電容量を示す容量性過渡現象が大幅に増加すると、全細胞構成が観察されます。保持電流(ベースライン)のわずかな増加も観察される可能性があります。アンプを電流クランプモードに設定し、セルの電位を-50〜-60mVに調整します。

5. Synaptic Connectivityのテスト

1. データ集録(DAQ)システムを構成して、発光ダイオード(LED)ドライバをトリガして光パルスを生成します。ここでは、ナショナルインスツルメンツのDAQシステムとMatlabを使用して、アナログ信号をLEDドライバに供給します。LEDの強度は、ドライバーへのアナログ信号を介して調整されます。LEDは波長620〜630nmのLEDです。
2. 高出力の赤色LEDを製剤の真下に配置します。0.238 mW/mm² がフライに到達するように光量を調整します。
3. 目的のシナプス後細胞から記録しながら、シナプス前ニューロンを活性化します。細胞の活性化を光遺伝学的、薬理学的、または神経刺激によって達成します。ここでは、csChrimson と赤色光の短いパルスが適用されます.
   注:シナプス接続は、興奮性シナプス後電位(EPSP)としての電流クランプまたは興奮性シナプス後電流(EPSC)としての電圧クランプのいずれかで監視できます。40 msの光パルスに応答してTTXを適用する前に、シナプス結合が見える必要があります。接続が観察されない場合、ニューロンが単シナプスまたは多シナプス的にシナプス的に接続されている可能性は低いです。保持電位は、それに応じて興奮性または抑制性の結合を強調するように調整されてもよい。
4. 通常の生理食塩水で接続が観察された場合は、灌流システムにTTXを添加して最終濃度1μMを達成します。再循環ポンプを使用して生理食塩水を捕捉して再利用し、TTXを節約します。蠕動ポンプは、浴から生理食塩水を引き出し、それを生理食塩水リザーバーに戻します。
5. ポンプの速度を調整して、浴内の生理食塩水レベルが上下しないように、強力で一定の真空を提供します。
   手記：TTXの適用により、全細胞で監視されているニューロンのスパイク活動が停止するはずです。これにより、生理食塩水に十分なTTXが追加されていることが確認されます。
6. 赤色光の短いパルス(各パルスで40ミリ秒)を再度印加します。この時点で、残っているシナプス結合は単シナプスである可能性が高いです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
UAS-csクリムゾン	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	55135	神経活性化剤として使用
UAS-ナチバック	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	9466	TTXの細胞における興奮性の確認
テトロドトキシン	トクリス	1078	TTXは規制薬物であるため、購入には特別な許可が必要な場合があります
すべてのトランスレチナール	シグマ-アルドリコールトランスレチナール	R2500	チャネルロドプシンの補因子が必要
溶接可能な321ステンレス鋼板、厚さ0.002インチ、幅10インチ	マクマスター・カー	3254K7	カスタムフライホルダーを作るために使用されます。カスタムホイルは、付属のPDFファイルから pololu.com でレーザーカットできます
解剖顕微鏡	ツァイス	ステミ2000-C	調製物の解剖に使用
ワクサー	アルモア	エクトラワクサー66000	フライインホイルを固定するために解剖中に使用
パラフィンワックス	ジョアン	4917217	ワクサーと併用
ナンバー5鉗子	ファインサイエンスツール	#5CO	解剖および被覆除去に使用
解剖ハサミ	ファインサイエンスツール	15001-08	解剖中にキューティクルの一部を取り除くために使用されます
タングステンワイヤー	A-Mシステムズ	797500	電気分解と併用して、解剖用の鋭利な針を作成します
蠕動ポンプの往復	Simply Pumps(アマゾン)	PM200Sの	再循環TTX用
蠕動ポンプ用スピードコントローラー	Zitrades(アマゾン)	該当なし	LEDライトまたはリボン用PWM調光コントローラー、12ボルト8アンペア、調整可能な明るさライトスイッチ調光コントローラーDC12V 8A 96W LEDストリップライトB
Versa-Mount 精密圧縮空気レギュレータ	マクマスター・カー	1804T1	パッチング中に陽圧を加えるため
ガラスのキャピラリー	世界の精密機器	TW150F-3	パッチピペット用
多目的ゲージ	マクマスター・カー	3846K431	圧力調整器用ゲージ
電気生理学カメラ	Dage MTIの	IR-1000	IR範囲(850 nm)で動作するカメラはすべて機能します。赤いイルミネーションを使用するとcsChrimsonがアクティブになる可能性があるため、使用しないでください
赤外線LED	ソーラブ	M850F2	斜め照明用
IR LED用光ファイバー	ソーラブ	M89L01	IR LEDへの結合
対物レンズ	オリンパス40X	LUMPlanFLN	これはほとんどの小細胞で使用でき、ハエのニューロンを視覚化するのに適しています。
オレンジ色のLED	ソーラブ	M590L3Dの	RFPとmCherryの可視化に
青色LED	ソーラブ	M470L3Dの	GFPの可視化に
GFPフィルターセット	彩度	49011	GFPの可視化やチャネルの刺激2rhodopsin
カスタムmCherryフィルターセット	彩度	ET580/25XおよびT600LPXR(49306セットから)ですが、ET610LPバリア/エミッション光学系を備えています	識別されたニューロンにchannel2rhodopsinでパッチを適用する場合にのみ使用
琥珀色と青色LEDを組み合わせたダイクロイック	ソーラブ	DMLP550R	mCherryの下のパッチのみを使用し、青色光でchannel2rhodopsinを励起します。
赤色LED	LEDサプライ	クリー XPE 620 - 630 nm	csChrimsonの運転に使用
LEDドライバー	LEDサプライ	3021-D-E-1000	光遺伝学的刺激のためのLEDの駆動に使用
マニピュレータ	サッターインストゥルメント	MP-225	録音中にピペットを位置決めするために使用されます
パッチクランプアンプ	A-Mシステムズ	モデル2400	同等のアンプが適しています
ベッセルフィルター	ワーナー・インストゥルメンツ	LPFの202A	パッチング中にオシロスコープへの電流トレースをフィルタリングするために使用される補助フィルタ。
データ収集システム	ナショナルインスツル	NI PCIe-6321 781044-01	アンプからコンピューターにデータを記録するために使用されます
端子台 - BNC端子 BNC-2090A	ナショナルインスツル	779556から01	アンプをDAQカードに接続するために使用されます。
スチールホイル	マクマスター・カー	3254K7	カスタムレコーディングチャンバー用スチールホイル
磁石	K&Jマグネティックス	D42	リングスタンドに記録室を固定する
1/16 "セルキャストアクリルクリア	ポロル		カスタムレコーディングチャンバーを作成するために使用されます。アクリルは、付属のPDFファイルから pololu.com でレーザーカットできます