ラットモデルに頭部電極システムを埋め込むことで、リアルタイムに発作を検出

要約

出典:Kozák, G., et al.ラットにおける慢性経頭蓋電気刺激と皮質内記録。J. Vis. Exp. (2018年)。

このビデオでは、麻酔をかけたラットに頭部上の電極システムを埋め込んで、リアルタイムの発作検出を行う方法を実演しています。この手順には、刺激電極と記録電極を配置し、歯科用セメントで固定し、ヘッドマウントアンプに接続することが含まれます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 刺激電極の作製

1. 1つの刺激電極を作成するには、長さ10 cmのミニチュアフックアップワイヤーを6本切断し、一方の端のクラッディングを2 cm、もう一方の端を1 cm取り外します。
2. 2本のケーブルをねじり合わせ、剥がした短い方の面にはんだ付けします。
3. SOT-353(Small Outline Transistor-353)ケースを使用して、あらゆる集積回路の3テープパッケージのストリップを入手します。
4. 撚り線をパッケージの3つの穴に通します。ワイヤーの剥がれた部分が長い方をパッケージの空洞にする必要があります。絶縁体の端が穴の端と揃うようにケーブルを配置します。
5. デンタルセメントを穴に入れてワイヤーを固定します.
   注意： 歯科用セメントは、パッケージの空洞に漏れないように十分に密度が高い必要があります。
6. セメントが固まったら(最低10分)、パッケージを裏返し、穴に瞬間接着剤の薄い層を入れて、多孔質セメントに向かって水密シールを形成します。剥がれたワイヤーを接着しないでください。
7. 剥がした短い方のケーブルでケーブルをねじり合わせ、はんだ付けします(図1A)。
8. 細いピンセットの先端でワイヤーの長い剥がれた部分をつかみ、転がして空洞に巻き込みます(図1B)。必要に応じて、余分なケーブルを切断します。

2. 記録電極の作製

1. 記録用三重項電極を1本作る(図1C-D)には、高速回転鋸で長さ1cmのステンレス管を切断します。鋭利な針でチューブの端からフィンを取り外し、チューブに破片がなく、完全に透過性があることを確認します。
   手記： ペンチはチューブを歪めるので使用しないでください。
2. 金メッキの基板スペーサーピンを最短3cmで曲げると、J字ホルダーになります。「J」字型の長い方の脚をカットしてはんだ付けすると、元の形状に戻ると、脳定位固定装置が保持する長い直線状部分と、電極を保持するU字型との間に取り外し可能な接合部ができ、アンカーポイントとして機能します。チューブと「J」ホルダーの短い方の脚を接着します。安定性のために、必要に応じて、追加の1cmの長さのバーを接着します。
3. 長さ2.5cmの電極線をステンレス製の極細ハサミで3本カットします。カットが明確で鋭利であること、および電極ワイヤの円形表面で絶縁体が損傷していないことを確認してください。また、力が加わってカット先端が曲がっていないか確認してください。各ワイヤの一方の端を1mmまたは2mm異なる角度(たとえば、1つは左ストレート、1つは45°、1つは直角)で曲げて、区別できるようにします。
4. チューブにワイヤーを充填します。実験用の電極の適切な間隔を選択します(例えば、皮質局所電位(LFP)および電流源密度(CSD)の登録の場合、チューブの開口部からのワイヤの先端の推奨突出は、それぞれ4.5mm、4.1mm、および3.7mmです)。適切なチャネル順序を維持するために、どのワイヤがどの深さに対応するかに注意してください。
5. ワイヤーが互いに隣接してチューブと平行になったら、電極ワイヤーを固定するために、チューブの両端に鋭い針で液体瞬間接着剤を1滴置きます。毛細管現象により、接着剤がチューブに流れ込んでいることを確認してくださいが、突き出た端の記録部位に向かって流れていないことを確認してください。
6. 使用する記録システムに対応した適切なマイクロコネクタを備えた電極インターフェースボードを準備します。
7. ワイヤの非記録の曲がった端を、目的の記録チャネルに対応する電極インターフェースボードの穴に導入します。すべてのワイヤーが所定の位置にあるとき、ピンセットで金のピンを穴に押し込みます.
   手記： ゴールドピンは歯科用セメントを使用して所定の位置に固定できますが、ほとんどの場合、この安全手順がなくても十分に安定しています。

3. 麻酔

1. 動物を密閉された麻酔導入チャンバーに入れ、2 L / minの医療用空気に4〜5%のイソフルランを充填します。
2. ラットが横臥になったら、動物をチャンバーから取り出し、適切な換気ノーズピースを備えた定位固定装置フレームに入れます。
3. イソフルランレベルを2%に設定しますが、気流の速度は同じままである必要があります。麻酔のレベルを確認してください。つまむことに反応して足の引きこもり反射がない場合は、続行し、そうでない場合は麻酔の深さを増やします。
4. 恒温モニタリングシステムにより、ラットの体温を37°C±0.5°Cにモニタリングし、維持します。角膜の乾燥を防ぐために、パラフィン軟膏の液滴を目に塗ります。.必要に応じて、手術中にこの手順を数回繰り返します。
5. 気道での粘液形成を避けるために、0.3 mg / kgアトロピンを皮下注射します。.長時間の手術の場合は、これを4時間ごとに繰り返します。呼吸を監視し、必要に応じて気化器を調整します。

4. 刺激電極の埋め込みと記録

>注:必要なすべての手術器具をオートクレーブし、全手順で無菌と消毒の一般的なルールに注意深く従ってください。手術部位の外側の非滅菌領域には触れないでください。電極をエチルアルコール(70%)に30分間浸漬してから、移植します。

1. バリカンで頭皮のほとんどの髪を取り除きます。脱毛クリームを頭皮に塗り、表面に均一に広げて数分待ちます。ヘラを使ってクリームと残りの髪をやさしく取り除きます。皮膚を水で洗い流し、次に消毒剤ですすいでください。
2. 1〜2%リドカイン(総用量7 mg / kgを超えないように)を皮下に注射して、皮膚を麻痺させます。.目に獣医軟膏を1滴塗ります(例:.、パラフィン)。
額から首にかけてメス
3. で正中線に長く(~2cm)矢状切開を徹底します。頭蓋骨から骨膜を含む組織を解剖します。次に、ノミまたは歯のピンセットを使用して、2つの側頭骨のクリステの間の領域を清掃します。4匹のブルドッグを使用して解剖した皮膚を引っ込め、頭蓋骨を露出させます。
4. 側頭骨の急な端と筋肉の間に細いピンセットをそっと置き、それらを分離します。ジギング運動をして、筋肉に損傷を与えることなく、できれば後頭骨の端から冠状縫合糸の平面まで、側頭骨の大きな表面をできるだけ露出させます。
5. リトラクターをバイテンポラリに配置して、側頭骨を露出させたままにします。
6. 頭蓋骨の表面を1〜2mLの3%過酸化水素(H₂O₂)ですすぎ、次に1〜2mLの水で洗います。
7. 側頭骨の表面を非常に慎重に風乾し、眼球棒で水分を拭き取ります。刺激電極が洗浄された垂直頭蓋骨表面に収まるかどうかをテストします(刺激電極の上端は、側頭骨のクリスタの端と一直線になっている必要があります)。必要に応じて、ブルドッグとリトラクターを再調整するか、ハサミで刺激電極を成形します。
8. 刺激電極の空洞を導電性ゲルで満たし、電極の縁に接着剤の薄層を置きます。
9. 刺激電極を側頭骨の乾燥した表面に1回正確な動きで置き、細いピンセットで1分間しっかりと固定します。接着剤に水分が接触していないことを確認してください。必要に応じて、眼の棒で拭き取ります.
   注意：電極が不安定になった場合は、電極を取り外してください。骨を洗浄した後、新しい刺激電極でこの手順を繰り返します。
10. 刺激電極の端に歯科用セメントを敷き、眼球スティックで組織内の漏れた水分を連続的に乾燥させます。次に、刺激電極全体をセメントで覆います。
11. セメントが完全に固まったら、反対側でこれらの手順を繰り返します。
12. 頭蓋骨全体にネジを固定するための穴を開けます。穴にミニチュアネジを打ち込み、その上に歯科用セメントを貼り付けます。ねじ径に比べて~10%小さい径のドリルヘッドを使用してください。
13. 実験の目的に応じて、ケーブルの端にコネクタをはんだ付けして表面に置き、セメントで覆うか、記録電極と光ファイバーを埋め込み続けるか、頭蓋骨の上に頭蓋窓を準備します。この後者の場合、コネクタをはんだ付けし、端部でのみ構造物に固定します。TESとLFPの同時記録を長期間行う必要がある場合は、単線ではなく前述の電極トリプレットを埋め込みます。
    手記： この設定により、コモンモード刺激アーティファクトの除去が可能になります8。記録電極の埋め込みの詳細については、以前のプロトコルを参照してください。
14. 露出したティッシュを消毒剤でたっぷりと洗います。1〜2%のリドカインを皮下注射します(総用量7 mg / kgを超えないようにしてください)。.
15. 創傷の端を創面切除し、コネクタ/インプラントの周りの単純な中断された縫合糸でそれらを閉じます。次に、傷口をポビドンヨードで消毒します。
16. 5 mg / kgのカルプロフェンを皮下注射します。.必要に応じてこれを繰り返します。
    手記： 他の鎮痛薬は、地元の倫理的許可委員会によって設定された要件に一致するように使用できます。
17. 麻酔を中断し、イヤバーとノーズピースを外し、動物を術後の回復ケージに入れて意識を取り戻します。
18. 術後の最初の数時間は、動物が綿密な監督下にあることを確認してください。インプラント領域を定期的に監視し続けます.
    手記： 動物は、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、放置しないでください。動物が手順から完全に回復するまで、動物を個別に収容します。

結果

図1:刺激と記録電極の作製手順。(A)撚り線を穴に通してパッケージに固定し、剥がしたワイヤーを空洞に巻き付けました。(B)刺激電極の最終形態。挿入図:パッケージの内側に巻き付けられたワイヤー。(C)記録電極の側面図;(D)記録電極の上面図。挿入図:記録部位の先端、400μm間隔。(E) 経頭蓋刺激電極の配置の術中画像。刺激電極は、いくつかの固定ネジとともに、すでに埋め込まれています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シアノアクリレート液	ヘンケル	ロックタイト401
シアノアクリレートゲル	ヘンケル	ロックタイト454
刺激電極用ワイヤー	フェニックスワイヤー株式会社	36744MHW - PTFEマイクロミニチュアフックアップワイヤー
基板スペーサー	E-tecインターコネクト	SP1-020-S378/01-55
コネクタ	E-tecインターコネクト	P2510I-02
刺激電極用テープ包装	ネクスペリア	74HC1G00GW	SOT-353ケースを備えたあらゆる集積回路のテープパッケージを使用できます
グリップセメント工業グレード	コーキングデンツプライ	675571(粉末)675572(溶剤)
導電性ゲル	レストラ	ECGジェル
記録電極線	カリフォルニアファインワイヤー株式会社	.002 (50 ミクロン) タングステン 99.95% (CFW 材質 #: 100-211)、HMl-Natural、3.0 インチにカット、丸型、カット長ピース ワイヤー
極細ハサミ	ハンマッハーインストゥルメント	ステンレスHSB 544-09
ステンレス鋼管	ヴィータニードルカンパニー	29 RW、304SSチューブ、TIG溶接およびプラグ
高速ロータリーソー	ドレメル	モデル#395
ロータリーソーホルダー	ドレメル	モデル#220
ロータリーソーカットオフホイール	ドレメル	モデル#409
眼球スティック	ローマン・ラウシャー	Pro-ophtaオキュラースティック
ウェット消毒剤	イージス	ベタジン
乾燥消毒剤	ワグナー・ファーマ	レセプチル尿素
ボール盤	NSK-Nakanishi イギリス	Vmax35RVパック
固定ネジ	アントリンミニチュアスペシャリティーズ株式会社	000-120x1/16 SL バインド MS SS

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