ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部におけるシナプス電流の記録

要約

出典:Vasin, A., et al.ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部からのシナプス電流の焦点マクロパッチ記録。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオは、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部にあるシナプスボタンからのシナプス電流を記録する技術を示しています。この技術により、単一のシナプスブートンの活動をモニタリングすることができ、これは自発的または非同期的なシナプス活動が増強された突然変異型ハエ系統の研究に重要です。

プロトコル

1. 記録電極の作製

1. ガラス電極を引っ張る
   1. 微小電極プーラーには、次のプロトコルを使用します(材料の表を参照)。
      1. ライン1:ヒート510プル-速度30時間250;ライン2:熱490プル-速度30時間250.
         手記： 時間単位は単位あたり0.5ミリ秒に対応します。他の単位は相対的です。熱の値は、ランプテストが実行された後、すべてのフィラメントに対して調整する必要があります。
   2. 顕微鏡(倍率35倍)を使用して、引っ張られた電極の内径が7〜10μmの範囲にあることを確認します(図1A)。毛細管は、ほこりの蓄積を防ぐために密閉容器に保管してください。
2. 火磨き
   1. マイクロフォージを使用して、キャピラリー(最大熱値の80〜90%を1〜2秒間)にファイアポリッシュします(材料の表を参照)。研磨された電極の最終的な内径が5μmであることを確認してください(図1A)。
3. 曲げ
   注:高倍率の対物レンズの下で電極を筋肉の上部に配置するために、2つの曲げが行われます。
   1. 図1Bに示す装置を使用してください。電極をマニピュレーターに固定し、先端をフィラメントに触れないようにフィラメントの上に置きます。
   2. 熱値を最大値の60〜70%に設定し、マイクロフォージのペダルを1〜2秒間押します(材料の表を参照)フィラメントを加熱します。L字型の針を使用して、電極の先端をゆっくりと引き下げます(図1Bを拡大した図1B)。約90°で曲げます(図1C)。
   3. 鉗子を使用して手でトーチの炎の上に電極をかざし、最初の曲げから7〜10 mmの距離で、約120^°の角度で2回目の曲げを行います(図1C)。

>2. 追加の準備手順

1. 血リンパ様(HL3)溶液(mM)を調製する:70塩化ナトリウム(NaCl)、5塩化カリウム(KCl)、20塩化マグネシウム(MgCl₂)、10炭酸ナトリウム(NaHCO₃)、5トレハロース、115スクロース、5N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸(HEPES)、および1mM塩化カルシウム(CaCl₂)を調製し、pHを7.3〜7.4に調整する。溶液を冷蔵庫に保管し、毎週新鮮にしてください。
2. ガラスピペットの記録と同じ方法で刺激ピペットを作成しますが、曲げる必要はありません。
   手記：刺激電極の調製については、28および27で詳細に説明されています。火研後の最終的な直径は5〜7μmの範囲である必要があります。
3. シリンジに接続された微小電極ホルダーに刺激ピペットを挿入します。

3. 興奮性接合電流 (EJC) の電気的記録

1. 録音
   1. 調製したペトリ皿を顕微鏡ステージに置きます(図2)。参照電極をお風呂に挿入します。
   2. 記録電極にHL3溶液を充填します。10倍対物レンズ(材料の表を参照)の下で、電極を浴に浸し、マイクロマニピュレータ(材料の表を参照)を使用して、腹部セグメント2、3、または4の筋肉6および7の上に置きます(図3 A.1およびA.2)。
   3. 対物レンズを60倍に切り替えます(材料の表を参照)。落射蛍光または DIC 光学系を使用して、関心のある領域に焦点を合わせます。電極の先端をシナプスボタンの上に置きます(図3 B.1-3)。
   4. 電極を筋肉に非常に優しく押し付けます。過度の圧力は、神経筋接合部(NMJ)を損傷したり、自発的なシナプス活動の増加を誘発したりする可能性があります。電極の先端が詰まっていないことを確認してください-詰まっている場合は交換してください。
   5. アンプ、A / Dボード、およびコンピューターのスイッチを入れます。
   6. 電圧を選択しますamp アンプのモード。
   7. 取得ソフトウェアを起動し、「ギャップフリー」モードを選択します。
   8. コンピュータ画面上で小型の興奮性接合電流(mEJC)の出現を観察します。
   9. mEJCの振幅が0.2〜0.7 nA.
      の範囲にあることを確認します 手記：EJCが小さい場合は、記録電極に欠陥があるか、記録電極が適切に配置されていないことを示します。
2. 刺激
   1. マイクロマニピュレーターを使用して、視覚的制御下で、刺激電極を腹部セグメント2〜4の軸索の近くに配置します。
   2. 電極ホルダーに接続されたシリンジのピストンを引っ張って、軸索が電極の内側に引っ張られるようにして、負圧を加えます(図2)。
   3. 刺激装置の電源を入れます。アイソレーションユニットのノブを回して(資料の表を参照)、ゼロ電流を設定し、EJCが表示されるまで(またはしきい値に達するまで)ゆっくりと増やします。
   4. 刺激電流をEJCの観察の閾値と比較して約2倍に増加させて、閾値を超える領域で刺激を実行します
      手記：私たちの経験では、このような刺激強度は、活動電位の失敗や活動電位の発火を避けるために最適です。例えば、0.2mAの刺激電流でEJCが現れる場合は、実験全体で0.4mAの電流を使用します。

結果

図 1.マイクロピペット製造の最終ステップ。(A)引っ張って火で磨いた後の電極の先端。(B.1)先端曲げのセットアップ。(B.2)ボックス化された領域は右側に拡大されて表示されます。電極とフィラメントは、電極先端がワイヤーの少し上に配置され、接触しないように固定されています。(C.1)記録電極。(C.2)ボックス化された領域は右側に拡大されて示されています。第1の曲げの角度は約90°で、第1の曲げと電極の先端との距離は約1mmです。スケールバー= 3 mm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マイクロトーチ 1WG61	グレイナー	1WG61	マイクロトーチ
オリンパスBX61WI	オリンポス	BX61WI	正立顕微鏡
オリンパス ラムプラン FL N 60x	オリンポス	UPLFLN 60X	顕微鏡対物レンズ60X
オリンパスUPlan FL N 10x	オリンポス	ユープランFL N 10X	顕微鏡対物レンズ10X
ナリシゲマイクロマニピュレーター	成茂	MHW-3	3軸水圧マイクロマニピュレーター
npi Electronic GmbH ELC-03XS	npiエレクトロニックGmbH	ELC-03XS	電気生理学的アンプ
A.M.P.I マスター8	A.M.P.I.	マスター8	電気刺激装置
A.M.P.I アイソフレックス	A.M.P.I.	アイソフレックス	刺激アイソレーター
TMC防振テーブル	TMCの	〒63-9090	防振テーブル
TMCファラデーケージ	TMCの	81-333-90	ファラデーケージ
デジデータ 1322A	Axon インスツルメンツ	デジデータ 1322A	デジデータ
コンピュータ	谷間	デルディメンション5150	Win XP OSを搭載したコンピュータ
電極ホルダー	WPIの	MEH3SW	電極ホルダー
光学フィルター	オメガオプティカル	XF 115-2	緑色蛍光タンパク質(GFP)検出用フィルターキューブ
pクランプ 8	Axon インスツルメンツ	8.00.01	信号記録用ソフトウェア
クォンタン	社内ソフトウェア	-	信号処理用ソフトウェア
カントンS(野生型)	ブルーミントンストックセンター	64349	コントロールフライライン
CPXのSH1	J.T.リトルトンの寛大な贈り物	-	自発的なエキソサイトーシスの増加を伴うComplexinノックアウトフライライン
CD8-GFPの	ブルーミントンストックセンター	5137	ニューロン蛍光(GFP)タグ付きフライライン

の シリーズ シリーズ の 名