脳スライス中のニューロンを研究するための自動画像誘導パッチクランプ技術

要約

出典:Wu, Q., et al.脳スライスのニューロンの研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオでは、脳のスライスが記録室に固定され、関心のある細胞がコンピューター制御の顕微鏡を使用して特定され、焦点が当てられます。次に、自動画像処理システムがパッチピペットを正確に配置して、細胞膜を密閉し、電気信号を監視します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. システムのセットアップ

1. 圧力制御ユニットを構築します。
   1. 回路図(図1)に従って圧力制御ユニットを組み立てます。電気回路図(図1b)に従って製造されたプリント回路基板(PCB)に必要な部品をはんだ付けします。標準の抵抗器、LED(発光ダイオード)、金属酸化膜半導体電界効果トランジスタ(MOSFET)、コンデンサ、およびコネクタを使用してください。ソレノイドバルブをPCB(プリント回路基板)にはんだ付けします。エアポンプと空気圧センサーを電線でPCBに接続します.
      注意: 必要な部品がすべて揃ったら、圧力制御ユニットは約2時間で組み立てられます。
2. セカンダリ・データ・アクイジション(DAQ)ボードを接続します。
   1. 表1.
      に従って、プリント回路基板からのデータ出力をDAQボードに接続します 手記： DAQボードは「シングルエンドモード」で動作します。ポートマップはユーザーマニュアルに記載されています(資料の表を参照)。
   2. 「AIn Pr S」をアナログ入力(AI)チャンネルの1つに接続し、「R-Gr」をセカンダリDAQボードのアナロググランドの1つに接続します。
   3. アンプからのプライマリ出力をAIチャンネルの1つに接続し、グランドをセカンダリDAQボードのアナロググランドに接続します
      注意: 標準のBNCケーブルを使用して、 amplifier。
   4. もう一方の端をストリップし、正の信号(銅コアなど)をAIチャネルに接続し、グランド(コアの周りの細いワイヤ)をアナロググランドに接続します。複数のパッチ チャネルが使用されている場合は、2 番目のチャネルに対してこの手順を繰り返します。
      メモ:DAQボードへのアナログ入力は、後の手順で構成します。
   5. セカンダリDAQボードの電源出力に電源を接続します。ポンプには別の12V電源を使用してください。
3. チューブを接続します。
   1. エアポンプと2つのバルブを接続します。
   2. 最後のステップでは、3ウェイコネクタを使用して、バルブ2の上部ポートからのソフトチューブを圧力センサーとピペットホルダーに接続します。
   3. ピペットを2本使用する場合は、ピペットホルダーに接続されたチューブに別の3ウェイコネクターを追加します。パッチを当てるときは、バルブと使用中のピペットを手動で切り替えてください。
4. Autopatcher IG.
   をインストールします。 注:システム要件:Autopatcher IGは、Windows 7を実行しているPCでのみテストされています。他のオペレーティングシステムでは検証されていません。説明されている手順は、特に資料の表に記載されているハードウェアに適用されます。
   1. Autopatcher-IGをGitHub(https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG)からダウンロードします。
   2. Pythonをインストールします(バージョンとダウンロードアドレスについては、資料の表を参照してください)。
   3. コマンドラインターミナルで「pip uninstall PyQt4」と入力して、PyQt4ライブラリをアンインストールします。
      手記：システムは、QwtおよびOpencvライブラリとの互換性を実現するために、古いバージョンのPyQt4ライブラリを使用します。
   4. Pythonライブラリを歴史的なホイールファイル(http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/)からインストールします。次のファイルを見つけます: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl)、Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl)、Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none-win32.whl)、および Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl)。
      1. wheel ファイルをインストールするには、ファイルが保存されているディレクトリに移動し、「pip install ***wheelfilename***.whl」と入力します。「***wheelfilename***」を実際のファイル名に置き換えます。
         注: ホイール ファイル名の "cp27" は Python 2.7 を示し、"win32" は Windows 32 ビットを示します。「win32」が機能しない場合は、「win64」を試してください。
   5. CCD(電荷結合素子)カメラを制御するには、64ビット(https://www.qimaging.com/support/software/)用のインストーラーをダウンロードしてインストールします。次に、64ビット(https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release)用のMicroManagerをダウンロードして、Pythonでカメラを制御します。
   6. マニピュレータと顕微鏡ステージを制御するには、メーカーが提供する制御ソフトウェアをインストールしてください><。 手記： これにより、マニピュレータの制御に必要なドライバもインストールされます。インストールパッケージは、通常、CD-ROMで提供されます。
   7. セカンダリDAQボードを制御するには、DAQボードの購入時に付属のCD-ROMからユニバーサルライブラリをインストールします。
5. Autopatcher IGのハードウェアを設定します。
   1. 顕微鏡ステージとマニピュレーターコントローラーをUSBポートを介してコンピューターに接続します。
   2. 「configuration」フォルダ内の「ports.csv」設定ファイルで、ユニット0:顕微鏡ステージ、ユニット1:左マニピュレータ、ユニット2:右マニピュレータの順にCOMポート番号を割り当ててください。ports.csvファイル内の他のパラメータ(つまり、「SCI」と「1」)は変更しないでください。
      手記：COMポート番号情報は、製造元が提供するマニピュレータ設定ソフトウェアを実行することで確認できます。「設定」タブに移動し、「設定」と「モーション」ページを選択し、上部の各タブのラベルを読み取ります。または、この情報はPCデバイスマネージャーにあります。
   3. DAQボード上の圧力センサとパッチチャンネル1および2(ユニット1および2に対応)のアナログ入力チャンネル番号を割り当てます。「configuration」フォルダ内の「DAQchannels.csv」ファイルにチャンネル番号を入力します。
      手記：スプレッドシートではなくメモ帳アプリケーションで.csvファイルを開くことをお勧めします。これは、変更を保存するときに情報が変更される可能性があるためです。
6. Autopatcher IGを実行します。
   1. アンプ、顕微鏡コントローラー、マニピュレーターコントローラーの電源を入れます。アンプソフトウェアが実行されていることを確認します。
   2. Autopatcher IGをPythonでコマンドラインターミナルから次のように実行します:まず、Autopatcher IGがインストールされているディレクトリ(最も一般的なターミナルでは「cd」コマンド)を変更し、コマンドラインターミナルで「python Autopatcher_IG.pyw」と入力して、「Enter」キーを押します。
      注意: Autopatcher IGを実行する前にマニピュレータ制御ソフトウェアを実行しないでください。これは、顕微鏡ステージとマニピュレータを占有し、Autopatcher IGがハードウェアを見つけることができなくなるためです。マニピュレータ制御ソフトウェアは、Autopatcher IGが完全に起動した後、制御するモジュール(インラインヒーターなど)が追加されている場合に実行できます。
7. プライマリーピペットをキャリブレーションします。
   1. パッチピペットを引っ張ります。引っ張ったガラスピペットに内部溶液を入れ、ヘッドステージにロードします
      注:空のガラスピペットは、顕微鏡下で異なるコントラストを示し、不正確なキャリブレーションにつながる可能性があります。
   2. ピペットの先端を顕微鏡の視野に移動し、ピントを合わせます。ダイヤルパッドを使用してマニピュレーターや顕微鏡ステージを移動する場合は、キーボードの「z」を押して座標を更新します。
      手記：キーボード(顕微鏡ステージ:A/D-X軸、W/S-Y軸、R/F-Z軸、マニピュレータ:H/K-X軸、U/J-Y軸、O/L-Z軸、1/2-ユニット番号)で移動を制御する場合は、リアルタイムで座標が更新されるため、この操作は必要ありません。
   3. ピペットがロードされている対応するユニットのメイングラフィックユーザーインターフェース(GUI)にある[キャリブレーションの開始]ボタンをクリックします(図2).
      手記：キャリブレーションが完了すると、ポップアップウィンドウが表示されます。
      注意: キャリブレーションは自動的に行われ、約3.5分かかります。同じボタンをクリックすると(キャリブレーションの開始後に「キャリブレーションのキャンセル」に切り替えられます)、キャリブレーションの試行は中止されます。
   4. メインGUIの下部にある[キャリブレーションの保存]をクリックしてキャリブレーションを保存します(両方のマニピュレータの現在のキャリブレーションを保存し、将来ロードできます).
      注意: 低倍率(4倍または10倍)と高倍率(40倍)での視野は、二次キャリブレーションが正しく機能するために位置合わせする必要があります。位置合わせ手順については、使用している光学系のユーザーマニュアルを参照してください。
       

2. 自動パッチクランプ手順

1. 急性脳スライスを準備する
2. パッチクランプ用のガラスピペットを準備します。
3. 記録室の中央に脳のスライスを1つ置きます。スライスホールドダウンまたは「ハープ」でスライスを安定させます。
4. 蛍光細胞を検出します。
   1. 4Xレンズの下で関心のある領域を見つけます。顕微鏡ステージを移動するには、Click-to-Move(「CTM」)モードをオンにし、関心領域の中心をクリックします。または、キーパッドを使用して顕微鏡ステージを移動します(A / D-x軸、W / S - y軸、R / F-z軸)。
   2. 高倍率レンズに切り替え、キーパッドのR / Fを使用して顕微鏡をz軸に動かしてピントを調整します.
      注意: 低倍率レンズと高倍率レンズの下の焦点面がz軸で同じまたは類似するように、ウォーターバスレベルを調整することをお勧めします。
   3. メインGUI列の「Unit 0」にある「Detect Cell」ボタンをクリックします。セットアップのLEDまたはレーザー光源がTTL信号で制御できない場合は、手動でLED/レーザーをオンにします。セル検出が終了するとポップアップウィンドウが表示されます。
      1. 必要に応じてLED/レーザーをオフにしてください。セル座標のリストが「メモリ位置」GUIに表示されます。座標の横にある[X]ボタンをクリックして、リストから不要なセルを削除します。
      2. または、ターゲット細胞が蛍光標識されていない場合は、メインGUIの「マウスモード」をクリックします。目的のセルをクリックします。番号の付いた黄色の点がセルに表示され、セルの座標が「メモリ位置」GUIに表示されます。
5. セカンダリピペットをキャリブレーションします。
   1. ガラスピペットの1/3を内部溶液で満たします。ヘッドステージに取り付けられたピペットホルダーにピペットをセットします。
   2. 低倍率レンズを使用してください。ピペットを視野に持ってきて、キーパッド(H / K - X軸、U / J - Y軸、O / L - Z軸)を使用してフォーカスを調整します。「1」と「2」で1号機と2号機を切り替えます。
   3. 「Load calibration」をクリックして、プライマリ・キャリブレーションをロードします。メインGUIで、使用中のユニットの下にある「Secondary calibration」ボタンをクリックします。例えば、2号機を使用している場合は、「2号機」欄の「二次校正」ボタンをクリックしてください。ポップアップウィンドウの指示に従って、高倍率レンズに切り替えます。
6. ターゲットセルにパッチを適用します。
   1. 「MultiClamp」(つまり、アンプ)ソフトウェアが実行されていることを確認してください。「パッチコントロール」ボタンをクリックして、「パッチコントロール」GUIを開きます。このGUIを開くには、最大で数分かかる場合があります。
   2. 40倍レンズを使用するには、メインGUIの「Unit 0」欄の「40X」にチェックを入れてください。「メモリ位置」GUIの座標リストの関心のあるセルの横にある「移動」ボタンをクリックします。顕微鏡が細胞に移動します。
   3. メインGUIで使用されているユニットのCTMボタンをクリックして、マウスクリック後の動きを有効にします。目的のセルをクリックします。ピペットの先端がセルに移動します。
   4. 「パッチコントロール」GUIの「パッチ」ボタンをクリックします.
      手記：自動パッチ適用が開始され、圧力と抵抗を「パッチコントロール」GUIで監視できます。
      1. 「ユニット1が選択されました」ボタンを使用して、2つのユニット間で入力信号を切り替えます
         注:システムは、ターゲット細胞に接近し、負圧を加え、細胞膜電位を一致させ、一連の圧力と抵抗の閾値とロジックに基づいてギガシール形成を検出します。
      2. 「パッチコントロール」GUIのそれぞれのボタンをクリックして、任意の時点で自動プロセスを操作します。たとえば、もう一度「パッチ」ボタンをクリックしてパッチの試用をキャンセルし、「次のステージ」をクリックして、しきい値に関係なくパッチ適用プロセスを次のステップに進みます。
         注:ギガシールが形成されると、ポップアップウィンドウがユーザーに通知し、大きな負圧とともにザップを適用するオプションが表示されます。
   5. 「はい」を選択すると、ザップとサクションを組み合わせて慣らし始めます。または、「いいえ」を選択して吸引のみで慣らします.
      注:全細胞パッチが正常に完了すると、実験パッチログを保存するように促すポップアップウィンドウが表示されます。
   6. 実験パッチログ.
      注:パッチ適用の試用に失敗した場合、ポップアップウィンドウにユーザーに通知され、パッチプロセスがリセットされます。
   7. 手順 2.4 に戻り、別のセルで手順を繰り返します。

結果

>表 1.プリント回路基板(PCB)から二次データ集録(DAQ)ボードへの接続構成。この表を使用して、PCB出力(左から1列目)をDAQボード上のポート(左から2列目)に接続します。セカンダリDAQのポート名と番号は、シングルエンドモードを示しています。

の 名 の ...

PCB上の出口	DAQボード上のポート名	DAQボードのポート#	所見
DOUT V1	ポート A チャネル 1	22	コントロールバルブ1
DOUT V2

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CCDカメラ	Qイマージング	ロレラボルト
電気生理学リグ	サイエンティフィカ	SliceScope Pro 2000	顕微鏡とマニピュレーターが含まれています。この原稿で示しているメーカー提供のマニピュレータ制御ソフトウェアが「Linlab2」です。
増幅器	分子デバイス	マルチクランプ 700B	コンピュータ制御微小電極増幅器
デジタイザー	分子デバイス	軸索 Digidata 1550
LED光源	クールLED	ペー-100	488nmの波長
データ集録ボード	計測コンピューティング	USB1208-FS	セカンダリDAQ. マニュアルを参照してください:http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
ソレノイドバルブ	リー株式会社	LHDA0531115H
ポンプ座	バーチャル業界	VMP1625MX-12-90-CH
空気圧センサー	フリースケール半導体	MPXV7025G
スライスのホールドダウン	ワーナーインストゥルメント	64-1415 (SHD-40/2)	スライスアンカーキット、RC-40チャンバー用フラット、2.0 mm、19.7 mm
ニシキヘビ	アナコンダ	バージョン 2.7 (Windows 用 32 ビット)	https://www.continuum.io/downloads
ネジ留め式端子(2ピン)	スパークファン	PRT - 08084	ネジ留め式端子 3.5mmピッチ(2ピン)
NチャネルMOSFET 60V 30A	スパークファン	COM - 10213
DIPソケットはんだテール - 8ピン	スパークファン	PRT-07937
LED - ベーシックレッド 5mm	スパークファン	コム-09590
LED - ベーシックグリーン 5mm	スパークファン	コム-09592
DCバレル電源ジャック/コネクタ(SMD)	スパークファン	PRT-12748
ACアダプタ電源 - 12VDC 600mA	スパークファン	TOL-09442
フックアップワイヤ - アソートメント(ソリッドコア、22 AWG)	スパークファン	PRT-11367
ロッキングオスxメスxメスストップコック	アークプラス	RCX10-GP0
フィッシャーブランドタイゴンS3 E-3603フレキシブルチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14*171*129	外径:1/8インチ 内径:1/16インチ
BNCオス-BNCオス同軸ケーブル	Belkinコンポーネント	F3K101-06-E
560Ω抵抗(許容誤差5%)	ラジオシャック	2711116
ピコスプリッツァー	一般的なバルブ	ピコスプリッツァーII