Ex Vivoラット結腸における結腸求心性神経からの電気生理学的記録

要約

出典:Meng, Y. et al., ラットの結腸求心性線維の電気生理学的特性のインビトロ特性評価. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオは、ex-vivoラット結腸の結腸求心性神経の活動を記録する方法を示しています。このビデオは、両端にカニューレを挿入し、生理食塩水を注入して管腔内圧を上昇させる方法を示しています。圧力が上昇すると、神経信号が上昇し、その刺激を示します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 灌流液と試験化合物の調製

1. 5 Lのクレブス溶液を調製します:113 mM塩化ナトリウム、NaCl、5.9 mM塩化カリウム、KCl、1.2 mMリン酸二水素ナトリウム、NaH₂PO₄、1.2 mM硫酸マグネシウム、MgSO₄、25 mM重炭酸ナトリウム、NaHCO₃、1.2 mM塩化カルシウム、CaCl₂、および11.5 mMグルコース。溶液を95%_O2 + 5%CO₂ガス混合物で飽和させます。~500mLの酸素化クレブスを冷蔵庫で予冷します。
2. 必要に応じて、ストック試験化合物(エタノール中の1 mMカプサイシンおよび生理食塩水中の10 mM 5-ヒドロキシトリプタミン(5-HT))のアリコートを調製します。ストックをクレブス(浴用)および生理食塩水(管腔内投与用)で希釈し、使用直前に最終濃度にします。.

2. 記録電極の準備

1. 従来の電極プーラーを使用して、内側フィラメントのない標準的なガラス管(外径1.5mm)から記録電極を引き抜きます。プーラーの熱設定を調整し、引っ張られた電極のシャンクが20〜25mmになるように引っ張ります。

3. ティッシュコレクション

1. ペントバルビタールナトリウム(80 mg / kg、i.p.)を使用してラットを深く麻酔します。.
2. 無菌性を確保しつつ、メスを用いて腹壁の正中線切開を行い、腹腔を露出させます。腸間膜と他の組織を脇に引っ張って、結腸直腸を露出させます。
3. 動物を解剖顕微鏡の下に置きます。慎重に解剖することにより、左骨盤神経節(PG)を特定し、骨盤神経(PN)とそれに結合する腰椎内臓神経(LSN)を特定します。これらの神経をPG.
   から数ミリメートル離して切断します 手記：PGは結腸直腸接合部の近くにあります。通常、腰仙脊髄から3〜4 PNとPGへのLSNプロジェクト(図1)。
4. 結合骨を切開して直腸を露出させます。結腸直腸の上の組織(すなわち、膀胱など)を取り除きます。PGをそのままにしておくように注意してください。
5. ペントバルビタールの過剰摂取の静脈内注射によってラットを犠牲にします。PGの約3cm上で結腸を切除し、鉗子を使用して動物から結腸直腸を取り除きます。
6. 予冷したクレブス溶液で満たされたシャーレに結腸直腸を移します。結腸をやさしく洗い流して糞便を取り除きます。PGを損なうことなく、残りの膀胱やその他の組織を慎重に取り除きます。

>4. 結腸求心性神経の解剖

1. 結腸を記録チャンバー(20mL)に入れ、カルボゲン化クレブス溶液で組織を連続的に灌流します。灌流速度を15 mL/minに設定します。
2. 口腔端と肛門端の両方で結腸直腸をカニューレ状にします。生理食塩水による結腸の管腔内注入を、経口から肛門の方向に10 mL / hの速度で開始します。.
3. 解剖顕微鏡で主要なPGを見つけます。昆虫ピンを使用して神経節を露出させます。慎重に解剖すると、神経節から発せられ、結腸に向かって走っている神経の細い枝を見つけます(図1)。神経節の近くで神経を切断します.
   注:図1は、PGの遠位にある神経枝からの記録を示しています。神経には、骨盤内臓と腰部の内臓求心性線維の混合物が含まれていると思われます。あるいは、PNおよび/またはPGの近位にあるLSNから記録を行うことができる。
4. 加熱バスをオンにし、クレブス溶液を温めて、チャンバーの温度を34±0.5°Cに保ちます。

5. 吸引電極の準備

1. 事前に引っ張ったガラスピペット(ステップ2)を取り、解剖顕微鏡で検査します。電極の先端を一対の鉗子で折って、記録する神経の直径に適したサイズにします。
2. 先端を明るいフレアの近くに置いて面取りします。

6. 電気生理学的記録

1. 面取りされた電極を電極ホルダーに接続します。10 mLシリンジをホルダーのサイドポートに接続して、電極に負圧または正圧を加えます。
2. ホルダーをバイオアンプのヘッドステージに接続し、ヘッドステージをマニピュレーターに取り付けます。
3. 電極をティッシュバスに移動し、ホルダーの銀線に接触するまで穏やかに吸引して電極にクレブス溶液を充填します。電極の先端を神経の切断端に近づけ、負圧を加えて神経を電極に吸い込みます。神経の~1mmが電極に引き込まれ、しっかりと密閉されるように、さらに負圧を加えます。
4. バイオアンプの電源を入れ、フィルターを300〜3,000Hzに設定し、オシロスコープで信号を監視し、スパイクデータ処理ソフトウェアを備えたコンピューターを使用して神経信号(20kHzのサンプリングレート)と管腔内圧信号(100Hzのサンプリングレート)を記録します。

7. 結腸求心性感受性の試験

1. 出口カニューレの三方向タップを閉じて、結腸のランプ拡張を適用し、継続的に管腔内に注入します。管腔内圧が60 mmHgに達するまで監視し、60 mmHgに達すると、排水カニューレの三方向タップを開きます。

結果

図 1. in vitroでのラット結腸求心性神経の電気生理学的記録。ある。ラットのex vivo「チューブ」結腸調製の概略図。結腸直腸は、PGが取り付けられており、記録チャンバー内で超融合され、両端でカニューレ挿入されます。管腔内注入は、シリンジポンプを使用して行われ、経口から肛門の方向に移動します。結腸の膨張は、出口カニューレの三方向タップ(d)を閉じることによって行われます。PGからの細い神経枝を切断し、吸引電極を使用して記録します。LSN の支部と PG に結合する PN の 3 つの支部も示されています。結腸に突き出ている細い神経の近位切断端。b. 神経の遠位端が電極に吸い込まれます。c. 膀胱に突き出ている2つの細い神経の切り口。LSN:腰椎内臓神経、PN:骨盤神経。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ペントバルビタールナトリウム	上海ウェスタンバイオテック	B558
カプサイシン	シグマ	M2028
電極プーラー	マイクロデータインストゥルメント株式会社	PMP107
ニューロログシステム(バイオアンプ)	デジタイマー株式会社	ニューロログシステム
A/Dコンバーター	ケンブリッジ・エレクトロニック・デザイン	マイクロ1401
データ処理ソフトウェア	ケンブリッジ・エレクトロニック・デザイン	Spike2 バージョン 6
シルバーワイヤー	世界の精密機器	EP12
ガラス管	世界の精密機器	1B150-4
電極ホルダー	世界の精密機器	MEH3SBW
ヒーティングバス	叶える	GR150
解剖顕微鏡	ライカ	Zoom2000 (英語
解剖顕微鏡	世界の精密機器	PZMIII-BS
シガーライター	任意	NAの
手術用ツール	世界の精密機器	NAの
昆虫ピン	0.1mmのステンレス鋼線から自家製	NAの
3ウェイマニピュレーター	世界の精密機器	キトフR
ラット	任意	NAの	どんな緊張/性別でも使用できます。

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