脳血管内皮細胞におけるミトコンドリア機能の評価

Abstract

出典:Rellick, S. L. et al. Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオは、細胞外フラックスアッセイを使用して、脳血管内皮(CVE)細胞のミトコンドリア機能の評価を示しています。CVE細胞は、細胞外フラックス細胞培養プレートに播種されます。細胞外フラックスセンサーは、バイオアナライザーにロードしてキャリブレーションする前に水和されます。次に、セルを含むプレートを解析のためにロードします。

Protocol

>1. 細胞培養プレート上の脳血管内皮(CVE)細胞の播種と治療

1. CVE細胞(bEnd.3細胞)を96ウェルの細胞外フラックス細胞培養プレートに播種します:80 μL/ウェル。細胞培養プレートを37°Cで5%_CO2インキュベーターに入れます。注:ウェルあたり16×10個の³細胞は、24時間以内に60〜80%のコンフルエンシーに達します。
2. 細胞が化学物質にさらされている場合は、細胞がプレートの底に付着したら(播種後8〜24時間後)、処理を追加します
   手記：トランスフェクション実験では、完全な増殖培地に抗生物質を添加しないでください。

2. バイオアナライザーによるミトコンドリア機能の評価

1. アッセイを開始する前に、150 μLの細胞外フラックスキャリブラント溶液をプレートに加え、CO₂なしで37°Cで一晩インキュベートすることにより、細胞外フラックスセンサーカートリッジをキャリブラントで水和します。
2. プレートウォッシャーステーションを使用して、細胞培養培地をpH 7.0の細胞外フラックスアッセイ培地に交換します。細胞を_CO2なしで37°Cで30〜60分間インキュベー
トします。
3. 8 μM オリゴマイシン、4.5 μM カルボニルシアン化物 4-(トリフルオロメトキシ) フェニルヒドラゾン(FCCP)、10 μM ロテノン、および 10 μM アンチマイシン A の作業溶液を Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)で調製します。25 μLのストック溶液をカートリッジ注入ポートにロードします:ポートA、オリゴマイシン;ポートB、FCCP;ポートC、ロテノン、およびアンチマイシンAと細胞外フラックスアッセイ培地。表1に記載されているようにアッセイプロトコルを実装します。
4. 水和カートリッジをバイオアナライザーにロードし、「開始」ボタンをクリックしてキャリブレーションを実行します。キャリブレーションが完了したら、カートリッジの底板を取り外し、「カートリッジのアンロード」プロンプトをクリックしてセルプレートをロードします。すべての測定が完了するまでアッセイを続けます。
5. データファイルを開き、バイオアナライザーから速度値を取得します。データをスプレッドシート ファイルにエクスポートします。

>表 1.インストゥルメントランプロトコル。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
bEnd.3細胞株	ATCCの	CRL-2299	25-30 パッセージ
ダルベッコのモディファイドイーグルズミディアム(DMEM)	ATCCの	2002年30月
ウシ胎児血清	アトランタバイオロジカルズ	S12450	最終版 10%
ペニシリン/ステプトマイシン	ハイクロン	SV30010	1×100ストッキング
0.25%トリプシン0.03%EDTA溶液	コーニング	25-053-CIの
ピルビン酸ナトリウム	コーニング	25-000-CI	最終値で1.0μM
グルコース	シグマ	CASの50-99-7	最終で25 mM
オリゴマイシン	シグマ	O4876	最終値で1.0μM
カルボニルシアン化物4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)	シグマ	C2920	最終値で0.5 μM
ロテノン	シグマ	R8875	最終値で1.0μM
アンチマイシンA	シグマ	CASの1397-94-0	最終値で1.0μM
プレート式洗浄ステーション	タツノオトシゴバイオサイエンス
細胞外フラックスバイオアナライザー	タツノオトシゴバイオサイエンス	XFe96
細胞外フラックス細胞培養プレート	タツノオトシゴバイオサイエンス	102416から100
細胞外フラックスセンサーカートリッジ	タツノオトシゴバイオサイエンス	102416から100
細胞外フラックスキャリブラントソリューション	タツノオトシゴバイオサイエンス	100840-000
細胞外フラックスアッセイ培地	タツノオトシゴバイオサイエンス	102365から100	アッセイ前にPHバッファーを