Ex Vivoマウス空腸セグメントにおける腸間膜求心性神経活動の記録

要約

出典: Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Allegerent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (2016年)。

このビデオは、解剖されたマウス空腸セグメントで腸間膜求心性神経からの電気信号を記録するプロセスを示しており、組織の圧力と運動の変化が求心性神経活動に及ぼす影響を研究しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 空腸求心性神経の準備

1. -地元の倫理委員会によって実験前に承認された青年期または成体のげっ歯類のげっ歯類の安楽死を実行します(例:終末鎮静とそれに続く心臓穿刺、子宮頸部脱臼など).
   手記：私たちは、動物を犠牲にするために頸部脱臼を使用したため、組織がさらにin vitroで処理されるため、さらなる麻酔や術後ケアを必要とせずに実験を行うことができました
   手記：年齢は腸間膜求心性機械感覚機能を弱めることが示されているため、研究者には 1回の実験の期間中、特定の年齢層を順守することをお勧めします。
2. 犠牲にした実験動物を仰臥位に置き、メスを使用して、剣状突起から恥骨まで伸びる皮膚と腹部筋層を通じて腹部正中線切開を行います。
3. 腹腔内組織(クレブス組成:120.03 mM NaCl、6.22 mM KCl、1.57 mM NaH₂PO₄、15.43 mM NaHCO₃、1.21 mM MgSO₄、11.52 mM D-グルコース、1.52 mM CaCl₂)を冷たいクレブス溶液で浸します。
4. 十二指腸空腸屈曲のすぐ遠位から約20cmの小腸を切除し、周囲の構造を傷つけないように注意し、空腸血管と求心性神経を含む腸腸間膜を無傷に保ちながら、鋭利なハサミを使用して空腸全体を迅速に切除します
   手記： 腹腔内の単なる空腸解剖の場合、肉眼で簡単に視覚化できるため、実体顕微鏡を使用する必要はありません。
5. 切除した空腸を氷冷したクレブス溶液に入れ、クレブス溶液をカルボゲン(95%O₂、5%CO₂)で継続的に酸素化しながら氷上に保ちます。.
6. 空腸を鋭利なハサミで約3cmの長さのループに切ります。血管と内臓神経を含む腸間膜束を、それぞれのループの中心近くのどこかで観察します。
7. 鈍いカテーテルを使用してクレブス溶液で各セグメントを洗い流し、管腔内容物と粥液を除去します。これには、in vitroで組織サンプルの劣化を促進する消化酵素が含まれているためです
   手記： 絨毛が破壊されると、求心性神経活動を変化させる可能性のあるメディエーターが放出されるため、フラッシング中にループの内腔を損傷しないように注意してください。
8. 求心性神経活動を測定するセグメント(例:Treitzの靭帯の遠位にある最初の空腸セグメントまたは十二指腸空腸屈曲)を特定し、これをシリコンエラストマー層でコーティングされた専用の記録チャンバーに配置します。
   手記：空腸の始まりは、解剖学的にトレイツの靭帯が小腸を横切る小腸の部分として定義され、十二指腸空腸屈曲とも呼ばれます
   手記： 実験開始のかなり前に、記録チャンバーの底部を薄いシリコーンエラストマー層で覆います。このエラストマー層は、製造元の指示に従って準備します。
9. 10 ml/minの速度で温かいカルボゲン化クレブス溶液をチャンバーに絶えず灌流し、記録チャンバー内のクレブス温度を34°Cに一定に保ちます。
10. 空腸セグメントを臓器浴に取り付けて、口腔端が管腔の流れを提供するシリンジドライバーに接続され、アブラル端が流出に接続するようにします。セグメントを少し伸ばしますが、過度の張力をかけないように注意してください。4/0シルクリガチャーを使用して両端をインフローポートとアウトフローポートにしっかりと取り付けます。
11. シリンジドライバーを口腔端に取り付け、空腸セグメントをクレブス溶液(非酸素化、周囲温度)で10 ml / hrの速度で管腔内に ?? 流します。.
12. 昆虫ピンを使用して、取り付けられた腸セグメントの腸間膜をシリコンエラストマーの底層に対して平らに固定します。腸間膜を伸ばして、腸間膜束の視覚化を最適化します。束や空腸に負担をかけないでください。
13. 腸管セグメントの管腔内圧が60mmHgに達するまで出力ポートを閉じて、マウントされたセグメントから管腔内クレブス溶液が漏れていないことを確認することにより、テストランプ膨張(vide infra)を実行します。管腔内圧の滑らかな上昇を中断することなく観察します。
14. 初期膨張期におけるセグメントの小さな収縮(蠕動波)を観察します。必要に応じて、1 μM の L 型カルシウム チャネル遮断薬ニフェジピンをクレブス溶液に添加して蠕動活性をブロックします。
    手記：ニフェジピンに加えてクレブス溶液に1μMのアトロピンを追加すると、腸管が完全に麻痺します。
15. 実体顕微鏡の下で、脂肪組織に埋もれている血管と求心性神経を傷つけないように注意しながら、2つの小さなピンセットで腸間膜から脂肪組織をそっと剥がし始めます。
16. 空腸から離れたところから始めて、腸間膜束の両方の血管を露出させます。
17. 両方の血管の間にある求心性空腸神経を、脂肪組織にカプセル化された細い白い糸として観察します。腸間膜血管および/または求心性神経の両方の最初の識別が困難な場合は、ピンセットを使用して脂肪組織をそっと剥がすことにより、空腸に向かってより近位に解剖するのみ。
18. 神経に付着している脂肪組織を除去することにより、セグメントの空腸間膜神経を数ミリメートルの距離にわたって自由に解剖します。
19. 鋭利な組織ハサミを使用して神経を切断します。必要に応じて、残りの脂肪と結合組織、およびエピニューロンシースを小さなピンセットでそっと引っ張って剥がします。
20. マイクロマニピュレータを使用して、プランジャー付きシリンジに接続された吸引電極の先端を臓器浴に下げ、プランジャーを操作して臓器浴からクレブス溶液を穏やかに吸引し、電極の先端がクレブス溶液に沈めるようにします(図1)。クレブス溶液が吸引電極内のワイヤー電極を覆っていることを確認します.
    手記：実験を開始する前に、ピペットプーラーを使用して、ワイヤー電極を含むホウケイ酸ガラス吸引キャピラリーを準備します。
21. 吸引電極の先端を、切断された求心性神経鎖のすぐ隣に配置し、切断された神経鎖をその全長にわたって毛細血管に引き込みます。
22. 電極の先端を脂肪組織に向けて操作し、プランジャーでしっかりと吸引しながらガラス毛細血管に吸引し、それによって臓器浴の内容物から毛細血管内の神経を機械的に「密封」します。
23. データ収集システムを使用して、求心性発火のランプ膨張誘発性増加(vide infra)を実行するなどして、求心性神経活動の記録を確認します。神経を吸引電極に分離した後、実際の実験を行う前に、自発的な求心性神経活動の安定した状態を得るために、準備を15分間安定させます。
24. ランプ膨張を行うには、出力ポートを閉じて腸管を伸ばし、圧力が徐々に上昇します(最大60mmHg)。目的の実験プロトコルは、3回連続してランプ膨張(15分間隔)すると、再現性のあるマルチユニット放電が得られる場合にのみ行ってください(図2)。

結果

図1:専用の記録チャンバーと吸引電極の概略図。 吸引電極と記録チャンバーが所定の位置にある技術セットアップの詳細な概要。

図2:空腸求心性神経活動のin vitro記録の代表的なトレース。 ベースライン時および60 mmHgまでの2回のランプ膨張(下パネル)に応答した空腸マルチユニット求心性神経活動(imp.sec-1)(上パネル)の典型的な記録、およびその後の神経信号の異なる単一ユニットの識別(ウェーブマーク分析)(3番目のパネル)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化ナトリウム(NaCl)	VWRケミカルズ	2,78,10,295	化合物クレブス溶液
塩化カリウム(KCl)	アクロスオーガニック	196770010	化合物クレブス溶液
リン酸二水素ナトリウム(NaH2PO4)	VWRケミカルズ	1,06,34,61,000	化合物クレブス溶液
重炭酸ナトリウム(NaHCO3)	メルク	1,06,32,91,000	化合物クレブス溶液
硫酸マグネシウム(MgSO4)	メルク	1,05,88,61,000	化合物クレブス溶液
塩化カルシウム(CaCl2)	メルク	2,38,11,000	化合物クレブス溶液
D-グルコース	VWRケミカルズ	1011175P	化合物クレブス溶液
蒸留水			化合物クレブス溶液
PVCチューブ	科学実験用品		腸管はPVCチューブの上に取り付ける必要があります
シリコーンチューブ	科学実験用品		チューブの残りの部分は、理想的にはシリコンベースで、チューブ内の破片をより簡単に取り除く
絹糸	ピアソール・リミテッド	10B15S220	PVCチューブ上のセグメントの取り付け
シリンジドライバー	ハーバード大学装置	〒55-2222	クレブスの管腔内注入
双眼鏡 - Oculairの10倍の倍率を含む	ツァイス STEMI 2000		求心性神経の解剖に最適な可視化
ホメオサーミックブランケットコントロールユニット	ハーバード大学装置	507214	オルガンチャンバーの加熱
シルガードで覆われた底のカスタムメイドオルガンバス
Spike2ソフトウェア			データの記録と分析
虫ピン 500個入り ステンレス製 直径0.2mm	アウステルリッツ昆虫ピンminutiens		求心性神経の解剖
ピンセット デュモン #5 イノックス 11cm	世界の精密機器	500341	求心性神経の解剖
はさみ、春、14 cm	世界の精密機器	15905	求心性神経の解剖
DBデジタイマ	NL 108T2/10		圧力トランスデューサ
マイクロマニピュレーター	成茂	M-3333	吸引電極の3D操作
マイクロマニピュレーター	X-4回転ブロック		吸引電極の3D操作
マイクロマニピュレーター	GJ-8 マグネットスタンド		吸引電極の3D操作
光源	Euromex顕微鏡オランダEK-1		求心性神経の解剖に最適な可視化
CED1401記録装置			求心性神経活動の記録
Humbug 50/60Hz ノイズエリミネーター	Questサイエンティフィックインスツルメンツ		バックグラウンドノイズの除去
輸液ポンプ	ギブソンミニパルス2		セグメントが取り付けられている臓器室の注入
微小電極ホルダーハーフセル 1.5 mm	世界の精密機器	MEH2SW	求心性線維を分離するための吸引電極
ホウケイ酸ガラスキャピラリー、300個、1.5/0.84 OD/ID	世界の精密機器	1B150-4	求心性神経を分離するための毛細血管

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