鋤鼻感覚ニューロンからの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立

要約

出典: Ackels, T., et al. In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronnasal Organ. J. Vis. Exp. (2016)

プロトコルビデオは、マウスの鋤鼻器官(VNO)の感覚ニューロンからの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立について説明しています。蛍光標識された感覚ニューロンを備えた冠状VNOスライスを記録セットアップに配置します。標識されたニューロンは、化学刺激に応答して電気生理学的記録のために、全細胞構成の記録ピペットでパッチされます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 溶液の調製

1. 細胞外溶液S₁:4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸(HEPES)緩衝液(mM)145 NaCl、5 KCl、1 CaCl₂、1 MgCl₂、10 HEPESを含む細胞外溶液を調製します。pH = 7.3(NaOHで調整);浸透圧= 300 mOsm(グルコースで調整)します。
2. 細胞外溶液 S₂: 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 5 KCl, 1 CaCl₂, 1 MgSO₄, 5 ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸 (BES); pH = 7.3; 浸透圧 = 300 mOsm (グルコースで調整) を含むカルボゲン酸素化 (95% O₂, 5% CO₂) 細胞外溶液を調製します。
3. 組織包埋用の4%低ゲル化温度アガロース溶液(S₃)を調製する:4%低ゲル化温度アガロース。2 gの低ゲル化アガロースを50 mLのS₁に溶解し、100 mLのガラス製実験用ボトルにマグネチックスターラーとともに溶解します。アガロースを溶かすには、ボトルを70°Cの水浴(蓋がしっかりと閉まっていない状態)に約20分間、または攪拌しながら溶液が透明になるまで入れます。溶かしたアガロースを冷却し、さらに使用するまで42°Cの2番目のウォーターバスで保管します。
4. 細胞内溶液S₄を調製する:143 KCl、2 KOH、1エチレングリコール四酢酸(EGTA)、0.3 CaCl₂(遊離Ca²⁺ = 110 nM)、10 HEPES、2アデノシン5′-三リン酸マグネシウム塩(MgATP)、1グアノシン5′-三リン酸ナトリウム塩(NaGTP);pH = 7.1(KOHで調整);浸透圧= 290 mOsmを含有するピペット溶液。
5. 個々の実験デザインに従って、S₁、S₂、およびS₄の組成を変更/調整します(例:.、特定のタイプの電圧活性化電流を分離するための薬理学的ブロッカー)。

2. VNOの解剖と埋め込み

1. CO₂に短時間さらして動物を犠牲にし、鋭利な外科用ハサミを使用して首を切る。注:動物を犠牲にしてからVNOカプセルを氷の上に置くまでの時間が重要なため、時間を2分未満に最小限に抑えてください。組織の生存率を維持するために、完全に解剖した両方のVNOをアガロースに30分以内に埋め込みます。
2. 大きな手術用ハサミで下顎を取り除きます。口の空洞から入り、両側の下顎骨と筋肉を別々に切ります。
3. 頭の残りの部分を逆さまにして大きなシャーレに置きます。
4. 中型の鉗子で上顎の皮膚と鼻の先端の周りを引き離し、切歯へのアクセスを改善します。
5. 骨はさみを使用して、切歯の大部分を吻側方向に~45°の角度で切り取ります(図1A)。これにより、鼻腔からのVNOカプセルの取り外しが容易になります.
   手記：VNOカプセルの先端の損傷を防ぐため、歯の根元まで切らないでください。
6. 硬い上口蓋を中型の鉗子で吻側部分でつかみ、平らな角度で慎重に一枚ずつ剥がします(図1B).
   手記：氷冷した_S2で繰り返しすすぎます。
7. マイクロスプリングハサミを使用して、鋤骨の先端と顎の間の骨の融合を切断します。先端の湾曲した部分がVNOから離れて外側を向くようにハサミの先端を挿入し、VNOカプセルの左側と右側の両方で骨を細かく刻んで慎重に切断します。
8. VNOカプセルを取り外すには、マイクロスプリングハサミを使用して尾側の鋤骨を切り抜き、中鉗子を使用して鋤骨を鼻腔から慎重に持ち上げます。すぐにVNOをアイスゲルパック上の実体顕微鏡下の小さなシャーレに移し、そこで解剖の残りのステップを実行します。
9. 組織が乾燥するのを防ぐために、少量の氷冷した_S2でVNOをすすぎます。
10. 中鉗子で鋤骨の裏側をつかむことにより、VNO軟部組織を含む軟骨嚢を分離します。カプセルを背側から見えるように配置し、両方のVNO間の分割が見えるようにします(図1D_i)。
11. 細い鉗子の先端を使用して、鋤骨を後部に固定したまま、両方の軟骨VNOカプセルを中央の骨から分離します。
    手記：鉗子は軟骨嚢の縁でのみ使用し、繊細な感覚上皮が損傷しやすいため、軟骨を貫通しないように細心の注意を払ってください。
12. 2 つの VNO が分離されたら、最初の VNO をカプセル化する軟骨の取り外しを開始します。
13. 1本の細い鉗子でカプセルの上縁をつかみ、以前に鋤骨(内側)に付着していた軟骨壁を裂きます。
14. 残っている軟骨を取り除くには、側面が湾曲したVNOを皿の底に向け、鉗子を使用して片側の軟骨をしっかりと固定します。2番目の細い鉗子を裏側から軟骨とVNOの間の非常に平らな角度で慎重に動かし、組織と軟骨の間の接続を緩めます。
15. 感覚上皮の損傷を避けるために、VNOを尾側の先端に保持して、軟骨からゆっくりと剥がします。
16. VNOがカプセルから出されたら、スライスプロセス中に残りの軟骨部分が周囲のアガロースから組織を剥離するため、残っている小さな軟骨部分をすべて取り外してください。
17. 最初に解剖したVNOに氷のように冷えたS₂を少量垂らして、組織の損傷を防ぎます。外側の大きな血管が見えるようになり、臓器がまだ無傷であり、解剖中に大きな損傷を受けていないことを示します(図_2Aii)。万が一血管が損傷した場合でも、全体の形態が明らかに損なわれていない限り、VNOのスライスを続ける価値があります。
18. すぐに2番目のVNOを解剖します。
19. VNOを埋め込むには、両方の小さなシャーレを溶かした_S3を縁まで満たします(42°Cの水浴に保存;1.3を参照)。
20. 感覚上皮の損傷を避けるために、細い鉗子でVNOを広い尾側の端に保持します。
21. VNOをアガロースに浸し、水平に数回前後に動かして、細胞外溶液のフィルムとその表面から気泡を取り除きます。
22. 尾側が皿の底を向くようにVNOを垂直に配置します。VNOを鉗子で直接つまむのではなく、鉗子の先端をVNO.
    に近接させて方向を調整します 手記：埋め込み中の向きは、実験中のスライス面と感覚ニューロンへのアクセス性を決定するため、非常に重要です。
23. ジェルアイスパックに皿を置き、アガロースが固まるまで待ちます.
    注:アガロースが固化し始めたら、周囲のアガロースから組織を切り離すため、VNOの向きを変更しないでください。

>3. コロナルVNO組織スライス

1. 小さなヘラを使用して、小さな皿からアガロースブロックを大きなペトリ皿の蓋に移し、VNOの尾側先端を上に向けてアガロースを逆さまにします。
2. 外科用メスを使用してブロックをピラミッド型に切ります(先端が3〜4 mm、下部が8〜10 mm)。埋め込まれた組織を傷つけないように注意してください。
3. 瞬間接着剤を使用してピラミッド型のブロックをビブラトーム試料プレートの中心に固定し、接着剤が完全に乾くまで~1分待ちます。
4. 試料プレートをスライシングチャンバーに移し、それに応じて2番目のVNOを準備します。プレートを2番目の試料と一緒に使用するまで4°Cに保ちます。
5. 次の設定で振動ブレードミクロトームを使用してください: 厚さ: 150-200 μm; 速度: 3.5 a.u. = 0.15 mm/秒; 周波数: 7.5 a.u. = 75 Hz. スライスを酸素化チャンバーに移し、解剖顕微鏡でスライスの形態を短時間検査した後、使用までスライスを酸素化チャンバーに移します。スライスは数時間保存できます。

4. シングルセル電気生理学的記録

1. 記録には、水浸対物レンズ、Dodtまたは赤外微分干渉コントラスト(IR-DIC)、落射蛍光を備えた直立固定ステージ顕微鏡、および冷却電荷結合素子(CCD)カメラを使用します。データ集録には、パッチクランプアンプ、ヘッドステージ、アナログ/デジタル/デジタル/アナログ(AD/DA)インターフェースボード、コンピュータ(録音ソフトウェアを含む)を使用します。
2. 10-20個のパッチピペット(4-7MΩ)のストックを準備します。ホウケイ酸ガラスキャピラリー(外径1.50 mm[OD]/0.86 mm内径[ID])からマイクロピペットプーラーを使用してピペットを引き出し、マイクロフォージでファイヤーポリッシュします。
   手記：ピペットチップのファイヤーポリッシュは、かなり小さいVSNにパッチを当てるときに重要です。これにより、負圧を加えるときに細胞膜が破裂するのを防ぎ、高抵抗のシールを得ることができます。研磨後、ピペットの開口部は約1μmである必要があります。
3. ピペットはピペット保管ジャーに入れて保管し、使用するまで損傷やほこりの蓄積を防ぎます。
4. 実験デザインに従って溶液リザーバーとチューブを充填することにより、灌流システムを準備します。
   手記：チューブから気泡を完全に取り除いてください。これは、電気生理学的記録に強く干渉するためです。
5. 圧力を調整して~3 ml/分の流量を達成します。
   手記：高圧は、組織切片の動きを引き起こし、電気生理学的記録の終了を引き起こします。
6. VNOスライスをイメージングチャンバーに移し、厚さ0.1mmの合成繊維で配線されたステンレス鋼アンカーを使用してスライス位置を固定します(図2B-C).
   手記：ティッシュスライスを合成繊維の糸で覆うのではなく、スライスを囲むアガロースで覆わないでください。
7. イメージングチャンバーを記録セットアップに移し、浴アプリケーションを介して室温で酸素化S₂でスライスを連続的にスーパーフューズします。
8. 吸引毛細管を溶液の表面に調整して、浴液を絶えず交換するためのゆっくりとした吸引を作成します。8-in-1マルチバレルの「灌流ペンシル」を上から、血管を含むVNOスライスの非感覚部分に近づけます(図2C、3A)。灌流ペンシルとレコーディングピペットを反対方向からスライスに向けるように配置すると便利です。
9. 参照電極と浴溶液をL字型寒天ブリッジ(150 mM KClで充填)を使用して接続します。
10. パッチピペットにピペット溶液Sを充填します₄.
11. ヘッドステージに接続された塩化銀コーティングされたパッチ電極にコーティングをこすり落とさずにピペットを取り付け、しっかりと取り付けます。
12. 浴に入る前に、パッチピペットにわずかな陽圧(10 mlのプラスチックシリンジで約1 ml)を加えます。.
13. マイクロマニピュレーターを使用して、対物レンズをぶつけずに水没させるのに十分な距離までピペットをバスに下げます(図2D)。
14. ヘッドステージに接続された電気生理学ソフトウェアを使用して、ピペット抵抗(R_pip、4〜7 MΩ)を監視します。
    手記：R_pipが<4MΩの場合、ガラスチップが壊れています。R_ピップが>10MΩの場合、チップが詰まっている可能性が高く、ピペットを交換する必要があります。
15. 赤外線に最適化された微分干渉コントラスト(DIC)を使用してCCDカメラでVNOスライスを視覚化し、蛍光照明と適切なフィルターキューブを使用して、細胞(または同様に標識されたニューロン)を発現するFPR-rs3-i-Venus(FPR-rs3:ホルミルペプチド受容体関連配列3)を特定します。
16. 実験デザインに応じて、蛍光細胞または非蛍光細胞に焦点を絞り、標的
化します。
17. 細胞体に近づくには、感度を最大にするためにハンドホイールを使用します。陽圧により、ピペットの先端が近づくと、細胞体膜の小さなへこみが見えます。
18. 正圧を解放し、わずかな負圧を加えて細胞膜を吸い込むと、高抵抗シール(1〜20GΩ)が得られます。短く穏やかな吸引を適用して、細胞膜を破壊し、細胞全体の構成を確立します。
19. 実験中はアクセス抵抗を常に監視してください.
    手記：小さくて安定したアクセス抵抗を示すニューロン(R_入力の≤3%、実験中に<20%)変化するニューロンのみを解析に含めます。

結果

図1:VNOの解剖。(A)切歯が切断される位置と角度を示すためのマウスヘッドの側面図。(B)上口蓋(UP)をつかんで剥がすのに最適なポイントを示す腹側図。(C)VNOを抱く軟骨嚢(CC)と、下顎、切歯、口蓋を切除した後の鋤骨(VB)の腹側図。(D)両方のVNOの両側局在を示す解剖されたVNOカプセルの背側図(D_i)。側面図は、両方のVNOを分離する必要がある背側の軟骨の縁を示しています(D_ii)。スケールバー= 1 mm(AD)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
化学薬品
アガロース(低ゲル化温度)	PeqLabの	35-2030
ATP(Mg-ATP)	シグマ・アルドリッチ	A9187の
ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸(BES)	シグマ・アルドリッチ	B9879
塩化カルシウム	シグマ・アルドリッチ	C1016
エチレングリコール四酢酸(EGTA)	シグマ・アルドリッチ	E3889
グルコース	シグマ・アルドリッチ	G8270
GTP(ナ-GTP)	シグマ・アルドリッチ	51120
(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)	シグマ・アルドリッチ	H3375-J
塩化マグネシウム	シグマ・アルドリッチ	M8266
塩化カリウム	シグマ・アルドリッチ	P9333型
水酸化カリウム	シグマ・アルドリッチ	3564
塩化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S7653
炭酸水素ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S5761
水酸化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S8045
手術用器具と消耗品
大型シャーレ、90 mm	VWRの		斬首、VNOカプセルの解剖
スモールシャーレ、35 mm	VWRの		VNO解剖用蓋、アガロース埋込用ディッシュ
シャープな大型手術用ハサミ	ファインサイエンスツール		斬首、下顎の切除
丈夫な骨ハサミ	ファインサイエンスツール		切歯
ミディアム鉗子、デュモンピンセット #2	ファインサイエンスツール		皮膚と口蓋の除去
マイクロスプリングハサミ、8.5 cm、湾曲、7 mm刃	ファインサイエンスツール		VNOの切り出し
細い鉗子2組、デュモンピンセット #5	ファインサイエンスツール		軟骨嚢からのVNOの解剖
小さなステンレス製ヘラ	ファインサイエンスツール		アガロースブロックとティッシュスライスの取り扱い
外科用メス			アガロースブロックをピラミッド型に切断
備品
増幅器	HEKA エレクトロニック	EPC-10
ホウケイ酸ガラスキャピラリー(外径1.50 mm / 内径0.86 mm)	サイエンス製品
CCDカメラ	ライカマイクロシステムズ	DFC360FX
フィルターキューブ、励起:BP450-490、抑制:LP515	ライカマイクロシステムズ	I3
蛍光ランプ	ライカマイクロシステムズ	EL6000
ホットプレートマグネチックスターラー	スナイデルス	34532
マイクロフォージ	成茂	MF-830
マイクロマニピュレーターデバイス	ルイグス&ノイマン	SM-5
マイクロピペットプーラー、垂直2ステップ	成茂	PC-10
顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	CSM DM 6000 SP5
ノイズエリミネーター50/60Hz(HumBug)	クエストサイエンティフィック
目的	ライカマイクロシステムズ	HCX APO L20x/1.00 W
オシロスコープ	テクトロニック	TDS 1001Bの
浸透圧計	ゴノテック	オスモマット030
灌流システム 8-in-1	オートメイトサイエンティフィック
pHメーター5イージー	メトラー・トレド
ピペット保存ジャー	世界の精密機器	E212
録音室	ルイグス&ノイマン	スライスミニチャンバー
カミソリの刃	ウィルキンソン・ソード社	ウィルキンソンソードクラシック
代替の商用チャンバーは、例えば、BSK1 Brain Slice Keeper(Digitimer)またはPre-chamber(BSC-PC;ワーナー・インストゥルメンツ)	オーダーメイド
実体顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	S4Eの
トリガーインターフェース	HEKA エレクトロニック	TIB-14 S
ビブラトーム	ライカマイクロシステムズ	VT 1000 S
ウォーターバス	メメルト	WNBの45