抑制性神経伝達物質ブロッカーの存在下での覚醒マウスにおける聴覚ニューロン応答の調査

要約

出典:Ayala, Y. A., et al.覚醒マウスにおける神経活性物質のマイクロイオントフォレティック適用と組み合わせたニューロン活動の細胞外記録。J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオは、マウスの脳の特定の領域で聴覚刺激を処理するニューロン活動の研究を示しています。この手法では、抑制性神経伝達遮断薬を塗布し、薬物を局所的な脳領域に適用する前後で、聴覚刺激に対するニューロンの反応を比較します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マイクロイオン導入のための薬

>注:マイクロイオントフォレーシスに使用される薬物は、水に溶解したときに電荷を帯びている必要があります。文献をチェックして、目的の薬物がこの手順に適しているかどうかを確認してください。ここでは、GABA_A受容体のアンタゴニストであるガバジンの手順について説明する。

1. 0.2 μmシリンジフィルターを使用して蒸留水をろ過して滅菌し、溶質が含まれていないことを確認します。この蒸留水を使用して、20 mMガバジンを~1,000 μl調製します。
2. 0.2 μmのろ過NaOHを細い先端のpH電極を用いて希釈液のpHを4に調整します。
3. 100 - 200 μlのアリコートを-20°Cで保存し、録音当日に解凍します。その日、動物が拘束される前に、柔軟なプラスチック針を取り付けた100μlのマイクロシリンジを使用して、マルチバレル電極のバレル(3〜5μl)に薬物を充填します。

2. 手術とヘッドポストの移植

1. 27 gと30 gの重量を持つ2匹の雄CBA / Jマウス(Mus musculus)で実験を行います。
2. 手術前の数日間は、動物を扱い、記録室を自由に探索させて、動物をそれに慣れさせます。1日3回のセッションを行い、各セッションは少なくとも30分続きます。これにより、録音中に落ち着き、快適になります。
3. ケタミン(50 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)を筋肉内に注射した混合物を使用してマウスに麻酔をかけます。この用量は、動物に約1時間深く麻酔をかけます。必要に応じて、初期用量の3分の1の追加用量を与えます。.
4. 38°C±1°Cの温度を維持するように設定されたヒーティングブランケットに動物を置き、2つのイヤーバーとバイトバーを使用して定位固定フレームで動物の頭を安定させます。耳のバールで鼓膜を突き刺さないように注意してください。
5. 眼科用ジェルを一滴垂らして目を保護します。
6. ハサミで頭皮を剃り、ポビドンヨードを塗って皮膚を消毒します。
7. メスを使用して、正中線に沿って切開して頭蓋骨を露出させ、頭頂骨と後頭骨のより吻側部分を覆う骨膜を引っ込めます。
8. 軽量のジュラルミン製ヘッドポスト(重量~0.65 g、長さ30 mm、図1A)を丸くて平らなベース(直径5 mm)で頭蓋骨に接着します。ヘッドポストの中央に銀線を接着し、両端を空けておきます。銀線は、電気生理学的記録の参照電極として使用されます。
9. 頭蓋骨とヘッドポストの基部に光硬化型接着剤の薄層を塗布します。10秒待ってから、ヘッドポストを頭頂骨の吻側領域、正中線に沿って
配置します。
10. 青色光源を使用して接着剤を20秒間光硬化させ、効果的な接着強度を実現します。
11. 電動ドリルと小さなドリルビットを使用して、ヘッドポストの基部の周囲と後ろに3つの穴を開けます。
12. ドリルで開けた穴に2本の時計ネジ(~2 mmの長さ)を配置して、頭蓋骨とヘッドステージの間の追加の接触点として機能します。ネジは、ぴったりとフィットするために11/2回転が必要です。鉗子でネジをテストして、緩んでいないことを確認します。
13. 銀色のアース線の先端を3番目の穴に挿入し、硬膜に接触していることを確認します。耐水性のシアノアクリレート接着剤を少量塗布して、ワイヤーを頭蓋骨に結合します。
14. 光硬化型複合材料を適用して、ヘッドポストと頭蓋骨の結合を強化します。ヘッドポストの基部、銀線の低い部分、ネジを覆い、ラムダの後ろに伸びないように注意して録音中にアクセスできるようにします。青色の光源を使用して硬化します。
15. 頭蓋骨への挿入付近で首の後ろの筋肉を引っ込めます。小さなトレフィン(直径2.35mm)を使用して、ラムダ縫合糸のすぐ下と正中線の外側に丸い窓を開けて、下丘(IC)を露出させます。境界線が緩んでいるときは、細かいピンセットでカバーボーンを引き上げます。出血が発生した場合は、冷たい滅菌生理食塩水ですすいで止まってください。
16. 複合材を使用して、窓の周りに小さな(幅~1mm、高さ~1mm)壁を作り、光硬化させます。
17. 露出した頭蓋骨と筋肉を抗生物質軟膏で覆います。次に、ICの露出面を滅菌生理食塩水で濡らし、ワセリンで覆い、記録窓の周囲に壁を作った後に生成されたウェルを充填します。
18. 鎮痛剤としてブプレノルフィンを皮下注射します(0.03 mg / kg、滅菌生理食塩水で1:10に希釈)。
19. 動物が目を覚ますまで加熱ブランケットの上に置いたままにし、セッションを記録する前に3日間手術から回復するために飼育ケージに戻します。ケージの仲間がゼリーとヘッドポストが金属グリッドカバーに触れているのを掃除するのを防ぐために、個々のラットのハウジングケージに動物を収容します。動物が一軒家であるときケージにいくらかの濃縮物を置きます。また、感染を防ぐためにおがくずを毎日交換し、動物が適切に回復し、不快感の兆候が見られないことを注意深く確認してください。また、ワセリンが露出した脳を保護している記録ウィンドウの上にあるかどうかを確認します。

3. 電気生理学的記録とマイクロイオン導入

1. 回復後、動物が録音環境に順応する時間を与え、頭を拘束します。マウスが体のサイズに合わせて彫られたカスタムメイドのクッション性フォーム拘束具に座っている間、ヘッドポストをホルダーに固定して動物を順応させます(図1B)。これにより、マウスの動きが制限され、その落ち着きに貢献します。
2. 10 分間のセッションから始めて、徐々に 120 分まで時間を長くします。セッション中、一定の間隔で動物に甘い液体(コンデンスミルク、水で30:70に希釈)を報酬として与えます。その後、録音セッション中に、セッションの開始時と終了時、またはニューロンが分離されていないときに同じ報酬を与えます。
3. 記録前に動物が興奮している場合は、軽度の鎮静剤アセプロマジン(2 mg / kg、腹腔内)を注射します。.関心のある神経系によると、鎮静剤は結果に影響を与える可能性があります。
4. 動物に記録室を5〜10分間自由に探索させます。
5. 動物の体をフォームカスタムメイドのクッション付き拘束具に入れます(図1B)。
6. ヘッドポストを定位フレームに取り付けられたホルダーに固定します(図1C)。これは、動物に液体の報酬を与えるのに良い時期です。
7. 動物の体を綿の毛布で覆い、プラスチック製の半円筒形と粘着テープを使用してゆるく固定します。
8. 記録窓からワセリンを取り出し、温かい滅菌生理食塩水ですすいでください。
9. ガバジンの神経活動とイオントフォレティックアプリケーションを記録します。
   1. マルチバレル電極をホルダーに置き、マイクロドライブで制御し、マイクロマニピュレーターに取り付けます。
   2. 小さなワニ口クリップを使用して記録用のワイヤーを接続します。プラス端子をタングステン電極の端に接続し、アース端子をデュラに接触する銀線に接続します。
   3. コーティングされていない銀線を各バレルの内側に配置して、一方の端が溶液に接触し、もう一方の端がアクセスできるようにします。これらの端をマイクロイオントフォレーシス装置に、製造元の指示に従って
   接続します。
   4. 先端が脳の表面に接触するまで、マルチバレル電極を動かします。脳組織の乾燥を防ぐために、温かい滅菌生理食塩水を適用します。その時点で、保持電流(ギャバジンの場合は-10 nA;特定の薬物の文献を確認してください)を印加して、単一ユニットの活性を探している間、バレル先端からの薬物の漏れを防ぎます。
   5. 単一のニューロンの細胞外活動を単離するための標準的な技術を使用します。ニューロンの周波数応答領域(FRA)、つまり、ニューロンがこれらの音に敏感であるために応答を誘発できる周波数と強度の組み合わせを取得します。
   6. 2つの周波数(f1とf2)を選択して、同様の発火率とパターンを呼び起こします。これらの周波数のそれぞれを、奇妙なパラダイムの下でのまれで反復的な刺激として提示します.
      手記：簡単に言えば、奇妙なパラダイムでは、1つの周波数(f1)は発生確率の高い反復刺激として提示され、2番目の周波数(f2)はまれに発生する逸脱刺激であり、反復刺激の間にランダムに散在しています。2番目の奇妙なシーケンスでは、2つの刺激の相対的な確率が逆になります。
   7. 電流を正の値(10〜20 nA)にシフトして、ガバジンを放出します。FRAを再度取得し、gabazineアプリケーションの下で奇妙なパラダイムを繰り返します。発火率に目に見える影響が観察されるまで、射出を維持します。通常、特定の薬物、その濃度、および放出電流の大きさにもよりますが、5〜20分かかります。記録プロトコルを繰り返して、薬物の効果下にある値を取得します。
   8. 電流を保持値に戻すことにより、インジェクションを停止します。FRAまたは奇妙なパラダイムへの応答が制御値に戻るかどうかを監視することにより、薬物の影響が洗い流されるのを待ちます。
      手記：録音セッションは1日あたり2〜3時間続くことがあり、動物が不快感や苦労の兆候を示している場合は、早めに終了する必要があります。液体の報酬を与え、記録チャンバーをワセリンで覆います。

結果

図 1.Awake Mice Recordings用のアクセサリー。(A)ヘッドポスト。(B)カスタムメイドのクッション性フォームレストレイン。マウスを両方のピースの間に置き、頭を外側に置きます。(C)脳定位固定装置フレームの改造。ヘッドポストホルダー(トップバー)は、ヘッドポストの埋め込み時にアシストし、記録中に頭を拘束します。バイトピース(下部バー)は、ヘッドポストの移植中にのみ使用されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
タングステンワイヤー	ハーバード・イスプラクティップメント・リミテッド	〒33-0099	0.005インチ x 3インチ
ホウケイ酸ガラスキャピラリー	ハーバード・イスプラクティップメント・リミテッド	〒30-0053	ホウケイ酸標準壁(フィラメントなし)、外径1.5 mm、内径0.86 mm、長さ100 mm
マルチバレルガラスキャピラリー	世界の精密機器	5B120F-4	5バレルキャピラリー、長さ4インチ、外径1.2 mm、フィラメント付き
ダイヤプラス	ダイヤデント	2001年-2101	光硬化型接着剤、タングステン電極をグラスマルチバレルピペットに取り付けるために使用されます
Gボンド	ジー・シー・コーポレーション	2277名	動物の頭蓋骨にヘッドポストを取り付けるために使用される光硬化型接着剤
カリスマ	ヘレウス・クルツァー	66000087	ヘッドポストと頭蓋骨の結合を補強するために使用される光硬化複合材料
アラルディットクリスタル	シーズ		タングステン電極のガラスマルチバレルピペットへの取り付けをさらに固定するために使用される2成分エポキシ
ヒーティングブランケット	シベルテック	RTC1
定位フレーム	成茂	SR-6N	マウス用に改変
マイクロイオン導入デバイス	ハーバード・イスプラクティップメント・リミテッド	ニューロフォアBH-2	IP-2イオントフォレーシスポンプ(ドラッグデリバリーチャネルごとに1つ)とバランスモジュールを含む
マルチバレルガラスピペットプーラー	成茂	モデルPE-21
LEDランプ	テクノフラックス	CV-215	5 W、430-485 nm
マイクロフィル	世界の精密機器	MF34G-5	フレキシブルプラスチックニードル、34 AWG
イマルジーン	メリアル		ケタミン、100 mg/mL
ロンプン	バイエル		キシラジン、20 mg / mL
ガバジン / SR-95531	シグマ	S106	蒸留水に20 mMガバジンを~1000 μl調製し、pHを4に調整します

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