ニューロン-アストロサイト共培養におけるニューロンネットワークの電気生理学的活性の記録

要約

出典:Taga, A., et al.地域特異的ヒト多能性幹細胞由来アストロサイトおよびニューロンを用いたALSのモデル化のための電気生理学的プラットフォームの確立。J. Vis. Exp.(2021年)。

このビデオは、ニューロンネットワーク活動を記録するためのニューロン-アストロサイト共培養の確立を示しています。運動ニューロンとアストロサイトの共培養を多電極アレイ(MEA)プレート上に確立すると、ニューロンネットワークの同期リズミカルな電気的活動がMEAを使用して細胞外に記録されました。

プロトコル

1. 多電極アレイプレートでのMNと脊髄アストロサイトの共培養

1. 運動ニューロンとアストロサイトを同じ日に使用する準備ができたときに、運動ニューロンとアストロサイトを分化してプレート化し、運動ニューロンのDIV(DIV)60とアストロサイトのDIV 90に老化させます。
2. 24ウェルプラスチックプレートを使用する場合は、次のようにメッキの前日または当日にMEAプレートをコーティングします(材料表)。
3. ポリオルニチン(PLO)を水またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で100 μg/mLに希釈します。
   1. 各ウェルに15〜20μLを添加し(ピペットの快適レベルによって異なります)、ウェルの中央に液滴を形成し、電極の領域と周辺領域をカバーしますが、ウェル全体ではありません。
   2. ピペットチップで電極を傷つけないように注意してください。各ウェルの同じ表面積をカバーするために、ウェルからウェルへの体積を一定に保ちます。
   3. PLOを37°Cで最低1時間(できれば2時間)インキュベートします
      手記： プレートに十分な湿度がない場合、少量は乾燥します。井戸を囲むコンパートメントに水を追加して、コーティングと録音の過程で十分な湿度を確保します。
4. プラスチック製のマイクロピペットチップを使用して、できるだけ多くのPLOを吸引します。電極に触れないように注意してください。250μLの水で3回洗浄します。洗浄に真空吸引器を使用する場合は、先端を電極アレイに近づけないでください。3回目の洗浄後、必要に応じてピペットチップを使用して、できるだけ多くの水を取り除きます。蓋を外した状態で、細胞培養フードの下で表面を乾かします。
5. プレート表面が乾いたら、PBSで10 μg/mLに希釈したラミニンを加えます。15〜20μLを使用して各電極アレイを覆います。湿度コンパートメントに水を加え、蓋を元に戻し、プレートを37°Cのインキュベーションに戻し、最低2時間から一晩
まで待ちます。
6. めっき当日は、運動ニューロン(MN)とアストロサイト培養物をPBSで一度すすぎ、トリプシン0.05%を37°Cで添加して細胞を浮き上がらせます(5分間)。トリプシン阻害剤を含む15mLの円錐形チューブに収集し、プレートを培地またはベースで洗浄して、すべての細胞が収集されるようにします。300 x gで5分間遠心分離し、1000 μLピペットで再懸濁して、1 mLの単一細胞懸濁液を生成します。MNとアストロサイトを再懸濁する場合は、共培養培地(表1)に切り替え、20 μM Rho関連コイルコイル形成タンパク質セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤(ROCK-I)を添加します。
7. 血球計算盤を使用して、MNとアストロサイトを並行してカウントします。カウントして計算しながら、細胞懸濁液にキャップをし、4°Cの発泡スチロールラックに置きます。
8. 運動ニューロンの場合は5 μLあたり5 x 10⁴細胞、アストロサイトの場合は5 μLあたり2.5 x 10⁴細胞の濃度で培養物を再懸濁するために必要な容量を計算します。1 mLの細胞懸濁液を300 x gで5分間遠心分離し、計算した容量に再懸濁します。
9. 播種する目的のウェルの数を計算し、各細胞懸濁液の5μLを掛けます。必要な量のニューロンとアストロサイト懸濁液を1:1の比率で組み合わせ、完全に(通常は2回)完全に混ざるまでピペッティングで混合しますが、攻撃的になりすぎないようにします。
10. ピペットチップを使用して、MEAプレートの各ウェルからラミニンを取り除きます。最終的な結合細胞懸濁液10μLを各ウェルに移し、電極アレイを覆う小さな液滴を形成して、ウェルあたり5×10⁴ MNおよび2.5×10⁴アストロサイトの細胞密度を提供します
    手記： 複合懸濁液中の細胞密度が高いため、播種ステップ中にウェル間で頻繁に再懸濁し、正確で一貫した細胞数を確保する必要があります。
11. プレートをインキュベーターに20〜30分間戻します。細胞の液滴を乱さないように注意し、細胞がプレート上に初期付着を形成するのを待ちます。
12. 20〜30分後、各ウェルの壁に250 μLをピペッティングし、続いて反対側の同じウェルの壁にさらに250 μLをピペッティングして、温かい共培養培地+ ROCK-Iを各ウェルに加えます。プレートをインキュベーターに戻します。
13. 播種の翌日(共培養1日目)にプレートを検査します。細胞の破片や死細胞が大量にある場合は、ROCK-Iを含む新しい共培養培地と交換してください。そうでない場合は、播種後2日目(共培養2日目)に培地をROCK-Iを含まない共培養培地に変更してください。ハーフミディアム交換(蒸発を考慮して50%を吸引し、最終量の60%を追加)を週に2回実行します。
14. シングルウェル30 mmガラスプレート(材料表)のMEAシステムを使用する場合、プレートの準備に2日以上かかる場合があります。これを行うには、以下の手順に従ってください。
15. 0.05%トリプシンで前のMEA培養物から細胞と細胞の破片を5〜15分間持ち上げます。
16. トリプシンを吸引し、水で3回すすいでください。
17. 70%エタノールを加えて滅菌し、フード内で10分間インキュベートし、エタノールを吸引し、水で3回すすいでください。
18. プロテアーゼ酵素を含む1%陰イオン性界面活性剤を水に塗布します。プレートに蓋をして熱可塑性フィルムとアルミホイルで包み、室温でロッカーに一晩置いておきます。
19. 洗剤を吸引し、水で3回すすいでください。
20. プレートを保管する場合は、十分な量の水を追加してください。プレートに蓋をして熱可塑性フィルムとアルミホイルで包み、次の使用まで冷蔵庫に置いておきます。
21. コーティングを計画している場合は、細胞培養フードの下で表面を乾燥させます。
22. 追加の滅菌が必要な場合(例:以前の感染または最近の使用以外)、この時点でのみ、MEAプレートをボンネットの下で紫外線(UV)に30〜60分間さらします
    手記：頻繁な紫外線を避けることで、電極の損傷を防ぐことができます。プレートに血清が付着している状態でUV光を使用すると、電極が機能しなくなるため、洗浄されたプレートにのみ使用する必要があります。
23. プレートが完全に乾いたら、プラズマクリーニングを1分間進めて、MEAプレートのガラス表面を帯電させ、コーティング効果を高めます。MEAプレートのクリーニング-メッキサイクルの少なくとも4〜5サイクルごとに1回プラズマクリーニングします。
    1. 別の方法として、血漿洗浄が不可能または保証されていない場合は、MEAプレートの表面を覆うのに十分な量のウシ胎児血清(FBS)含有培地を追加し、それらをインキュベーターに一晩戻します。
24. PLA(ポリオルニチン)/ラミニンコーティングを使用してください。プラズマ洗浄または吸引してFBS含有培地を洗い流した直後に、PLO溶液(PBS中100μg)を添加します。
25. 上記のように、次の密度で細胞をプレートします:1 x 10⁵ ヒト多能性幹細胞由来アストロサイト (hiPSC-A)/プレートおよび 5 x 10⁵ ヒト多能性幹細胞由来運動ニューロン (hiPSC-MN)/プレート。

>2. 多電極アレイ記録

1. 200 Hz のハイパス フィルターと 3 kHz のローパス フィルターを備えたバターワース フィルターを使用して、12.5 kHz のサンプリング周波数で生の電圧データを抽出します。スパイク認識を、ベースラインから ≥6 標準偏差の電圧の瞬間的な時点として設定します。バーストを 100 ミリ秒で >5 のスパイクが発生するアクティビティとして識別します。ネットワーク・アクティビティを定義するには、全アクティブ電極の35%以上が100ミリ秒以内に発火し、ネットワーク・バーストごとに最低50回のスパイクが発生する場合です。
2. Co-Culture (CC) Day 1.
   の後、できるだけ早く録音を開始してください。 手記： CC3日目まで電気的な活動が注目されることはめったにありません。
3. 生化学的アッセイ、免疫細胞化学(ICC)、または定量PCR(qPCR)のための適切な培養プレートまたはカバースリップで、同様の密度でパラレル培養をプレート化し、複製します。
4. 温度を37°C、_CO2を5%に設定して録音します。プレートを機械に移し、記録する前に少なくとも5分間平衡化させます。
5. ベースラインアクティビティを隔日または毎週、実験デザインに応じて1〜15分以上記録します。メディア交換後少なくとも1時間は録音せず、理想的にはメディア交換のたびに24時間待ちます。
6. コンタミネーションを防ぐために、滅菌プレートの蓋を滅菌フードの外側で開く必要がある記録(つまり、薬物化合物の適用)の後に、培地を交換します(つまり、ステップ1.14のような半培地交換)。プレートが薬物治療を超えて使用され続ける場合は、完全な培地交換と洗浄を行って薬物を洗い流します。
7. 分析目的では、各条件に対して少なくとも 3 回の技術的および生物学的レプリケートを使用します。n≥3回の反復の手段として電気生理学的データを表現します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 cm滅菌培養プレート	隼	353003
25 cm2 滅菌培養フラスコ	隼	353136
500 mL 0.2 μm CA フィルターシステム	コーニング	430769
5mLピペット	隼	357543
6ウェル滅菌培養プレート	隼	3046
Axion CytoView MEA 24 プレート (M384-tMEA-24W)	アクシオン	OPT-24
Axion Edge MEAプラットフォーム	アクシオン	マエストロエッジ
基底膜マトリックス - マトリゲル	コーニング	354277	プロトコルの詳細
卓上顕微鏡(細胞培養フードの下で滅菌)	ツァイス	415510-1100-000	プリモヴェール
毛様体神経栄養因子(CNTF)	ペプロテック	450から13	100 μgを1 mLの滅菌PBSに溶解し、9 mLの滅菌0.1%BSA-PBSを10 μg / mLに加えます。-80°Cで分注して凍結し、1:1000に希釈して使用します。(使用濃度10 ng / mL)。
Axion Edge用のCO2タンクとレギュレータ	エアガス/ハリス	9296NC
DMEM/F12	サーモフィッシャー	113300	作業集中力 1x
エッセンシャル8ミディアム+エッセンシャル8サプリメント	サーモフィッシャー	A1517001	10 mLのEssential 8(10x)サプリメントと500 mLのEssential 8 Growth Medium(1x)を組み合わせます
ウシ胎児血清(FBS)	サーモフィッシャー	16140071	作業集中力 1x
血球計算盤	選挙顕微鏡科学	63510から20
湿度制御細胞培養インキュベーター	サーモフィッシャー	370	37ºC、5%CO2に設定
ラミニン	サーモフィッシャー	23017-015	原液 1 mg/mL、使用濃度 10 μg/mL (コーティング)、1 μg/mL (細胞培地)
L-グルタミン	サーモフィッシャー	25030	2 mgのLDNを500 μLのクロロホルムに溶解して、10 mMのストックを得ます。これをアリコートし、-80°Cで凍結します。使用するには、まずストックを1〜10でDMSO[1 mM]に希釈し、次に1 mMの1:5000を目的の培地に希釈して、0.2 μMの作業溶液を得ます
MEAガラスプレート	マルチチャネルシステム	60MEA200/30iR-Ti-GR	作業集中力 100倍
マルチチャンネルピペット P200	ギルソン	PJ22224
神経基礎	サーモフィッシャー	21103049
非必須アミノ酸(NEAA)	サーモフィッシャー	11140050	作業集中力 1x
ペンシルリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャー	15140122	作業集中力 100倍
ポリオルニチン(PLO)	シグマ・アルドリッチ	P3655	作業集中力 100倍
塩化カリウム(KCl)	NAの	NAの	100 mgを1 mLのddWに溶解して、100 mg/mLのストック溶液を得ます。ストックを100 μLチューブに分注します。(使用濃度 100 μg/mL)
プルモルファミン(PMN)	ミリポアシグマ	540223	作業濃度100 mM
ROCK阻害剤	ペプロテック	1293823	再構成する前に短時間遠心分離します。100 μgを1 mLのPBSに溶解して100 μg/mLにした後、9 mLの滅菌0.1% BSA-PBSを10 μg/mLに加えます。-80°Cで分注して凍結し、1:1000に希釈して使用します。(使用濃度10 ng / mL)。
無菌細胞培養フード	ベイカーカンパニー	SG-600	5 mgを1480 μLのdH2Oに溶解して10 mMのストックを取得し、分注して-80°Cで凍結します。1:500で希釈して使用します。(使用濃度20μM)。
サプリメントB - B27 サプリメント	サーモフィッシャー	21985023
卓上細胞培養遠心分離機	サーモフィッシャー	75004261	作業集中力50倍
熱可塑性フィルム - パラフィルム	パラフィルム	P7793	ソルバルレジェンドX1R
トリプシン-EDTA(0.05%)	サーモフィッシャー	2530054	作業集中力 1x
ウォーターバス	サーモフィッシャー	2332	アイソテンプ