マウス脳内皮における細胞内カルシウム電位と膜電位の同時測定

要約

出典:Hakim, M. A. et al.新たに単離された無傷のマウス脳内皮における細胞内カルシウムと膜電位の同時測定。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオは、マウスの脳動脈セグメントの内皮細胞における細胞内カルシウムレベルと膜電位の変化を同時に測定する方法を示しています。単離された内皮チューブには蛍光カルシウムインジケーターが充填され、細胞内カルシウム放出を誘導する薬剤で治療され、膜電位が変化します。インジケーターの蛍光性によりカルシウムレベルの測定が可能となり、細胞内に記録電極を挿入して膜電位の変化を測定します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 脳動脈の解剖と分離

>注:すべての解剖手順では、実体顕微鏡による標本倍率(最大50倍)と光ファイバー光源による照明が必要です。脳と動脈を分離するための解剖手順を実行するには、鋭利な解剖器具を使用します。動脈を分離して洗浄するためのマイクロダイセクションツールには、鋭利な先端の細い鉗子やバンナススタイルの解剖ハサミ(3〜9.5mmの刃)が含まれます。

1. マウス脳の分離
   1. C57BL/6マウス(生後3〜30ヶ月、雄または雌)をイソフルラン(3%で2〜3分間)吸入して麻酔し、麻酔を完全に導入した直後に動物を斬首します。実体顕微鏡下で、冷たく(4°C)ゼロCa²⁺生理学的塩溶液(PSS)を入れたシャーレ(直径10cm、深さ1.5cm)にヘッドを置きます。
   2. 顕微鏡で観察し、頭蓋骨の上の皮膚と髪の毛を取り除き、冷たいゼロCa²⁺ PSSで余分な血液を取り除きます。標準的な解剖ハサミ(24mmブレードなど)の先端のみを使用して、後頭骨から頭蓋骨の鼻骨まで切開します。
   3. 粗い先端の鉗子を使用して切開部に沿って頭蓋骨を慎重に開き、結合組織を分離して、無傷のCycle of Willisで脳を分離します。
      注:あるいは、リタウアー骨切断鉗子を使用して頭蓋骨を開き、脳を露出させることもできます。
   4. 分離された脳をビーカーで冷たいゼロCa^{2 +} PSSで優しく洗い、血液を取り除きます。脳動脈を分離するための冷解剖液を含むチャンバーに、脳腹側を上に向けて置きます(図1A)。
2. 脳動脈の分離
   注: 後大脳動脈は、このプロトコルの代表的な脳血管内皮研究モデルとして選択されています。
   ガラスシャーレの
   1. 底部(深さ≥50cm)をコーティングする木炭注入シリコンポリマーに挿入するステンレス鋼ピン(直径0.2mm、長さ~11〜12mm)を使用して、分離された脳を冷解剖液に固定します。
   2. 解剖中にPSSの冷却温度を維持するには、1:1の水-エチレングリコール混合物を連続的に循環させる冷媒システムで冷却された解剖チャンバーを使用します。あるいは、新鮮な氷の上で解剖を行うこともできます。
   3. 後大脳動脈 (~0.3 から 0.5 cm のセグメント、軸方向の張力なし) を、Vannas スタイルのハサミと鋭利な先端の細い鉗子を使用して、後脳動脈と脳底動脈から外科的に分離します (図 1B)。ステンレス鋼のピン(直径0.1 mm、長さ~13〜14 mm)を使用して、ペトリ皿の解剖液に両方の孤立した後大脳動脈を固定します(図1C)。
   4. 鋭利な先端の細い鉗子を使用して結合組織を除去し、孤立した後大脳動脈を慎重に清掃します(図1D)。無傷の動脈をセグメント(長さ1〜2 mm)に切断して、酵素消化を行います(図1D;挿入図)。

2. 内皮チューブの作製とスーパーフュージョン

1. 対物レンズ(10倍、20倍、40倍)を搭載した顕微鏡、カメラ、チャンバーとマイクロマニピュレータを保持するアルミステージを使用してトリチュレーション装置を準備します。ステージと検体に隣接するポンプコントローラーでマイクロシリンジを固定します(図2A)。
2. トリチュレーションピペットを鉱物油で完全に埋め戻し、マイクロシリンジピストンに固定します。次に、ポンプコントローラー付きのマイクロシリンジを使用して、ピペット内に気泡がないことを確認しながら、解離溶液を鉱物油の上のピペット(~130 nl)に引き出します。
3. 0.31 mg/mLのパパイン、0.5 mg/mLのジチオエリスリトール、0.75 mg/mLのコラゲナーゼ、および0.13 mg/mLのエラスターゼを含む10 mLガラス管(図2B)の1 mLの解離溶液に無傷の動脈セグメントを入れます。.34°Cで10〜12分間インキュベートし、部分消化します。
4. 消化後、酵素溶液を~5 mLの新鮮な解離溶液と交換します。1 mLピペットを使用して、室温(RT)で解離溶液を含むチャンバーに1つのセグメントを移します。
5. ピペットをチャンバー内の解離溶液に入れ、消化容器の一方の端の近くに置きます。ポンプコントローラーで2〜5 nL / sの範囲内の速度を設定して、穏やかなトリチュレーションを実現します(図2C、挿入図)。
6. 100倍から200倍の倍率で見ながら、動脈セグメントを引き出して排出し、平滑筋細胞を解離させながら内皮チューブを生成します。必要に応じて、先端の細い鉗子を慎重に使用して、解離した外膜と内部弾性薄層を内皮チューブから分離します。すべての平滑筋細胞が解離し、内皮細胞のみが無傷の「チューブ」として残っていることを確認します(図2C)。
7. マイクロマニピュレーターを使用して、ホウケイ酸ガラスピンピペットを使用して、内皮チューブの両端を超融合チャンバーのガラスカバースリップに固定します(図2D)。
8. 解離した外膜細胞と平滑筋細胞をチャンバーから洗い流し、解離溶液を2 mM CaCl₂ PSSに置き換えます。固定された内皮チューブを備えたモバイルプラットフォームを、超融合および実験装置の顕微鏡に移します。
9. 必要に応じて、実験中にPSSおよびそれぞれの薬物溶液を連続的に送達するために、6つのクリーンな50 mLリザーバー(図3A)を使用してください。インライン流量制御バルブを使用して、流量を真空吸引に一致させながら、層流と一致するように全体の流量を手動で設定します。PSSをチャンバー(図3B)に送達し、内皮チューブの超融合を≥5分間行い、その後、バックグラウンドデータと色素のローディングを記録します。

3. 染料の負荷、ウォッシュアウト、および温度の設定

1. [Ca²⁺]_iを測定するための測光システムのすべてのコンポーネントをオンにします。実験装置(図3C)の顕微鏡を使用して内皮チューブを400倍の倍率で観察し、測光システムソフトウェアスイートを使用して測光ウィンドウ内の細胞に焦点を合わせます。
2. 内皮チューブの直径を測定し、340 nmと380 nm(≥10 Hz)での交互励起中の510 nm発光に一致するバックグラウンド自家蛍光値を記録します。
3. 細胞内Ca²⁺([Ca²⁺]_i)応答を測定するには、内皮チューブにFura-2 AM色素(Fura-2-アセトキシメチルエステル、最終濃度10 μM)を室温でロードし、光が当たらない状態で~30〜40分間待ちます。
4. 新鮮なPSSで内皮チューブの超融合を30~40分間再開し、余分な色素を洗い流し、細胞内Fura-2 AMを脱エステル化させます。ウォッシュアウト期間中は、インラインヒーター付きの温度コントローラー(図3A)を使用して温度を室温から37°Cまで徐々に上げ、実験中は37°Cに保ちます
   手記：室温から37°Cへの推奨される増分移行には、3つのステップ(例:5°C)が必要であり、各ステップで≥5分の平衡化時間が必要です。

4. [Ca²⁺]_iとV_mの同時測定

1. 他のすべての機器と、膜電位を測定するための電位計ソフトウェアスイートの電源を入れます(V_m、図3、図4を参照)。それに応じてデータ取得速度を調整します(≥10 Hz)。
2. 鋭利な電極を引っ張り、2 M KClで埋め戻します。色素転写による細胞間結合の研究には、2 M KClに溶解した0.1%ヨウ化プロピジウムを微小電極に埋め戻します。
3. マイクロマニピュレーターで固定された電位計ヘッドステージに取り付けられたピペットホルダーに、塩化物でコーティングされた銀線に電極を固定します。マイクロマニピュレーターを使用して、4倍対物レンズを通して見ながら、電極の先端をチャンバー内の流れるPSSに短時間配置します。
4. 静止状態の V_m を 0 に設定し、接地された浴電位と一致します。電極の先端を内皮管の細胞のすぐ上に配置します。必要に応じて、電位計にリンクされた可聴ベースラインモニターを使用して、音の高さを潜在的な録音に関連付けます。
5. 40倍対物レンズを使用して倍率を400倍に上げ、必要に応じて電極の先端を再配置します。測光ソフトウェアを使用して測光ウィンドウを調整し、~50〜80個の内皮細胞に焦点を合わせます。
6. マイクロマニピュレータを使用して電極を内皮チューブの細胞の1つに静かに配置し、静止している_Vmが安定するまで≥2分待ちます。同様に、第1の電極で突き刺した第1のセルから別のセル(距離≥100μm)に第2の電極を挿入します。
7. 静止状態のV_mが期待値(-30〜-40 mV)で安定したら、光がない状態で蛍光界面のPMTをオンにし、Fura-2を340nmと380nmで交互(10Hz)励起し、510nmで蛍光発光を収集することにより、細胞内[Ca²⁺]_iの獲得を開始します
   注:細胞間の電気結合をテストするには、電流(± 0.5-3 nA、~20秒のパルス幅)を1つの電位計で「サイト1」として供給し、_{V m}の変化を別の電位計で「サイト2」(距離≥100μm)として記録できます。
8. V_m と [Ca²⁺]_i の同時測定が確立されたら、薬物を適用する前に、内皮チューブと PSS の融合を一定の層流で ~5 分間待ちます。
9. PSSで調製した薬剤(アデノシン三リン酸[ATP]など)を、一定の流量で超融合チャンバーに塗布します。~3分後(または薬物の動態に適した時間)後、V_mとF₃₄₀/F₃₈₀比がベースライン状態に戻るまでPSSで洗浄します。.ソリューションの各移行中に、光度計と電位計ソフトウェアスイート全体でそれぞれの記録を一時的に同期するようにマークします。
10. 実験が完了したら、マイクロマニピュレータを使用して電極をセルから引き抜き、バス電極が参照するV_m ~0 mVを確認します。V_mと[Ca²⁺]_iのそれぞれの録音を停止し、データ分析のためにレコードをファイルに保存します。

結果

図1:脳からの脳動脈の分離 (A)解剖液中の無傷の動脈(白矢印は後大脳動脈)で分離された脳。(B) 後大脳動脈の拡大図(白矢印; ~3倍 vs.パネルA)。(C)標本皿にステンレス製のピンで固定された孤立した後大脳動脈。(D)結合組織の除去後の後大脳動脈。挿入図は、動脈の切断されたセグメントを示しています。スケールバー = 500 μm

図2:脳内皮チューブの準備。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
グルコース	Sigma-Aldrich(米国ミズーリ州セントルイス)	G7021
NaCl	シグマ	S7653
MgCl2	シグマ	M2670
CaCl2	シグマ	223506
ヘープス	シグマ	H4034-J
KClの	シグマ	P9541
NaOH	シグマ	S8045
ATPの	シグマ	A2383 (英語
HCl	サーモフィッシャーサイエンティフィック(米国ペンシルベニア州ピッツバーグ)	A466250
コラゲナーゼ(H型ブレンド)	シグマ	C8051
ジチオエリスリトール	シグマ	D8255
パパイン	シグマ	P4762
エラスターゼ	シグマ	E7885
BSAの	シグマ	A7906
ヨウ化プロピジウム	シグマ	P4170
DMSOの	シグマ	D8418
ふら-2 AM染料	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA (米国カリフォルニア州カールスバッド)	F14185
循環式冷凍機(Isotemp 500LCU)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	13874647
プレキシガラス超融合チャンバー	ワーナーインスツルメンツ、カムデン、コネチカット州、米国	RC-27
ガラスカバースリップ底部(2.4 × 5.0 cm)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12-548-5M
アルマイト処理されたアルミニウムプラットフォーム(直径:7.8 cm)	ワーナー・インストゥルメンツ	PM6 または PH6
コンパクトなアルミ製ステージ	シスキユー、グランツパス、オレゴン州、米国	8090P
マイクロマニピュレーター	シスキユー	MX10
実体顕微鏡	Zeiss, NY, USA (米国ニューヨーク州)	ステミ 2000 & 2000-C
光ファイバー光源	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss (英語)	フォステック8375
ニコン倒立顕微鏡	Nikon Instruments Inc.、米国ニューヨーク州メルビル	TS2
位相コントラスト対物レンズ	ニコンインスツルメンツ株式会社	(Ph1 DL; 10倍 & 20倍)
蛍光対物レンズ	ニコンインスツルメンツ株式会社	20倍速(S-Fluor)、40倍速(Plan Fluor)
ニコン倒立顕微鏡	ニコンインスツルメンツ株式会社	エクリプス TS100
マイクロシリンジポンプコントローラ(Micro4)	World Precision Instruments (WPI)、サラソタ、フロリダ州、米国	SYS-MICRO4
除振テーブル	テクニカルマニュファクチャリング、ピーボディ、マサチューセッツ州、米国	マイクロG
アンプ	Molecular Devices、サニーベール、カリフォルニア州、米国	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
ヘッドステージ	分子デバイス	HS-2AおよびHS-9A
関数発生器	EZ Digital、ソウル、韓国	FG-8002
データ取得システム	Molecular Devices、サニーベール、カリフォルニア州、米国	デジデータ 1550A
可聴ベースラインモニター	Ampol US LLC、サラソタ、フロリダ州、米国	BM-A-TM
デジタル・ストレージ・オシロスコープ	Tektronix、米国オレゴン州ビーバートン	TDS 2024B
蛍光システムインターフェース、ARCランプ+電源、ハイパースイッチ、PMT	Molecular Devices、サニーベール、カリフォルニア州、米国	IonOptixシステム
温度コントローラー	ワーナー・インストゥルメンツ	TC-344BまたはC
インラインヒーター	ワーナー・インストゥルメンツ	SH-27B
バルブコントローラー	ワーナー・インストゥルメンツ	VC-6
インラインフローコントロールバルブ	ワーナー・インストゥルメンツ	FR-50
電子プーラー	Sutter Instruments, Novato, CA, USA (米国カリフォルニア州ノヴァト	P-97またはP-1000
マイクロフォージ	成茂、イーストメドウ、ニューヨーク、アメリカ	MF-900
ホウケイ酸ガラス管(トリチュレーション)	World Precision Instruments (WPI)、サラソタ、フロリダ州、米国	1B100-4
ホウケイ酸ガラス管(ピン留め)	ワーナー・インストゥルメンツ	G150T-6
ホウケイ酸ガラス管(鋭利な電極)	ワーナー・インストゥルメンツ	GC100F-10
シリンジフィルター(0.22μm)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒722-2520
ガラスシャーレ+チャコールシルガード	Living Systems Instrumentation、セント・オールバンズ・シティ、バーモント州、アメリカ	DD-90-S-BLKの
バンナススタイルのはさみ(3 mm & 9.5 mm)	世界の精密機器	555640S、14364
はさみ3 mmおよび7 mmブレード	Fine Science Tools (or FST)、フォスターシティ、カリフォルニア州、アメリカ	モリア MC52 & 15000-00
鋭利な先端の鉗子	FSTの	デュモン #5 & デュモン #55